曹雁行 孙玉江 张志鹏 邹敬清 潘庆杰

（①山东省东营市畜牧局 257091 ②青岛农业大学动物科技学院 山东 青岛③东营职业学院 山东 东营 ④青岛德瑞骏发生物有限公司 山东 青岛）

马人工授精技术试验

曹雁行①孙玉江②③张志鹏④邹敬清④潘庆杰②*

（①山东省东营市畜牧局 257091 ②青岛农业大学动物科技学院 山东 青岛③东营职业学院 山东 东营 ④青岛德瑞骏发生物有限公司 山东 青岛）

为加快本地马品种改良采用马人工授精技术(AI)。结果表明，Selle Francais公马射精量为118.2±14.53ml，精子密度2.01±0.06亿/ml；常温下，精液稀释液A在1、2h内存活率分别为0.75±0.02、0.4±0.04，与进口的INRA96精液稀差异不显著(P＞0.05)；保鲜精液低温(0～5℃)保存48h，受精成功率为61.53%，保鲜精液48h后效果较差。鲜精、保鲜精液和冷冻精液的人工授精成功率分别为80.95%、61.5%、45.5%，差异均极显著(P＜0.01)。

马 人工授精 保鲜精液 冷冻精液

人工授精在我国应用始于上世纪三十年代，具有提高种畜利用率、减少饲养成本、控制疾病传播、加速品种改良等优点，曾为我国马的育种和新品种的培育起到重要作用。进入二十一世纪以来，现代马业迅速发展，进口马匹数量不断增加，人工授精、胚胎移植等新技术研究、开发与推广工作也同步发展，加快了优良马品种的繁育。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 Selle Francais(塞拉-法兰西)马、蒙古马、伊犁马。

1.1.2 设备试剂 主要设备有医用超声波清洗器、体视显微镜、冷冻仪、兽用B超仪、精子密度仪、高速冷冻离心机等。主要试剂有丙酮酸钠、Na2HPO4、KH2PO4、甘氨酸、D-无水葡萄糖、D-果糖、a-乳糖、进口精液稀释液等。

1.2 方法

1.2.1 采精 采用自行设计假台畜(专利号：201220037887.8)，按照《动物繁殖学[1]》进行采精、检测、输精、保鲜、冷冻，并统计采精量、精子活力、精子密度和授精成功率等。

1.2.2 精液稀释 参照动物精液稀释液的成分与组成[2-5]，设计了4个精液稀释液试验组，标记为稀释液A、B、C和D，分别在低温、常温下保存并镜检。

1.2.3 保鲜精液 根据精子密度和活率计算保鲜精液量。按照精子数不低于1×108[1]确定稀释比例，制作的保鲜精液量为10ml/份。

1.2.4 冷冻精液 精液与稀释液按1:3的比例进行稀释，稀释后检测精子活率高于50%。参照其家畜的冷冻精液制备方法[6]制作冻精细管。试验结果用excel、SPSS软件处理，ANOVA和Tukey分析，每次试验至少重复3次。

3 结果

3.1 精液品质鉴定

选取4匹Selle Francais公马的精液品质进行鉴定，从采精量、精子活率、精子密度等方面进行检测(表1)。

表1 公马精子质量检测结果 (ml、亿/ml、%)

从射精量看，Ⅲ号公马的精液量(133±26.3)高于I号、II号和IV号(P＜0.01)。从精子活率看，III号公马的精子活率(0.67±0.12)低于I号、II号和IV号(P＜0.01)。从精子密度看，III号公马的精子密度(0.75亿/ml)低于I号、II号和IV号(P＜0.01)。

3.2 人工授精时间

用I号、II号种公马精液进行105匹次输精，成功率为80.95%(图1)。人工授精情况显示，受孕率最高月份在4月份，达到94.1%；8月份受孕率最低。

图1 人工授精匹次数与受精成功率

3.3 精液稀释液

对精子在稀释液A、B、C和D常温(15～25℃)保存0、0.5、1、2和4h后，精子活率的变化情况进行统计。结果表明，常温保存下，稀释液A(发明专利号：20121002639 3.4)效果较好，精子在1、2h内活率分别为0.75±0.02、0.4± 0.04，与进口的INRA96精液稀差异不显著(P＞0.05)。释液稀释液B、C和D，精子活率下降比较快，与稀释液A差异显著。

表2 不同精液稀释液常温保存(15～25℃)马精子活率 （%）

保鲜精液低温(0～5℃)保存到48h后，精子存活比例达到58.7%；72h后，精子活力降到39.1%；96h后，精子活力降至21.6%。利用保鲜精液进行26匹次的授精试验，16匹次受孕成功，48h之内的受精成功率达到61.53%(图2)。

图2 保鲜精液精子存活比例与受精成功率

A图表示精液在低温保存12、24、48、72和96h后精子存活比例；B图表示精液在低温保存12、24、48、72和96h后人工授精的成功率。

3.4 冷冻精液 精液冷冻保存12、24、48、72、96、120和240h后，解冻并检查精子活率(如图8)，精液冷冻保存72h、120和480h后，精子解冻后活率分别达59.3%、58.7%和57.3%，活率保持在55%以上。对鲜精、保鲜精液和冷冻精液的人工授精成功率的比较表明，人工授精成功率分别达到80.95%、61.5%、45.5%。

图3 冷冻精液精子存活比例与受精成功率

图3 表示冷冻精液的精子存活比例与人工授精成功率。A图表示精液在冷冻保存12、24、48、72、96、120和480 h后，精子存活比例；B图表示鲜精、保鲜精液和冷冻精液的人工授精成功率比较。

4 讨论与结论

4.1 精液采集

作为种公马必须要保持遗传性能稳定[7]，生产性能优良，系谱清楚，检疫合格，这是开展人工受精技术的基础。因此，在做采精以前，首先对候选的种公马进行了初步选择，确定4匹Selle Francais参加采精试验。从精液检测结果看，Ⅲ号公马精液质量不稳定，顶体完整率较低，可能与年龄低(3岁)有关，因此，Ⅲ号公马暂不做为种用。其它3匹种用顺序为依次为I号、II号、Ⅳ号。

4.2 人工授精时间

影响人工授精效果的因素很多，马匹年龄、健康状况、精液质量、环境温度及输精技术等，马自身生理周期变化是内因。本试验表明，青岛地区马3～9月均可以发情，以5月最为集中，这也符合季节性发情动物的一般规律，即由短日照变最长日照时，公马精液量最大，母马开始发情；由最长日照逐渐变短日照时，公马精液量减少，母马一般不再发情。人工授精的效果与季节、母马发情周期变化密切相关。因此，青岛地区要抓住4～7月发情季节，尽早完成配种任务。

4.3 精液稀释液

稀释液是精子的保护剂，可以有效减缓精子运动、抑制精子代谢、延长精液保存时间。一般稀释液中都含有营养物质、缓冲剂、抗氧化物质、酶、抗菌素及微量元素等，稀释液成分、各成分的浓度及组分之间的比例都对精液保存质量有重要影响(徐振军等，2009)。常温保存(15～25℃)下，以牛奶、葡萄糖、棉子糖等为主要成分的稀释液A与法国进口产品其效果无显著差异。虽然对于INRA96的具体成分我们不清楚，但葡萄糖、棉子糖等可以提高精子活力，调节精液渗透压，以此延长精液的保存时间。

4.4 冷冻精液

冷冻精液的制作实现了优良种畜遗传资源的长期保存，目前，牛的冷冻精液保存期已经达到40年[8-10]。试验表明，短时间(0-6h)来看，随着时间的推移，精子活力也随之降低；但是长时间(6h以上)看，活率基本保持在55%以上。对鲜精、保鲜精液和冷冻精液的人工授精成功率的比较表明，如果条件许可，尽量不要使用冷冻精液。本试验采用0.5ml细管冷冻精液与0.25ml颗粒冻精进行了比较，显示同一稀释液细管冻精在解冻后活率方面有明显优势。

[1] 杨利国等. 动物繁殖学[M]. 北京: 中国农业出版社. 2003.

[2] 张沅. 家畜育种规划[M]. 北京: 中国农业大学出版社. 2001

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S821.3+4

A

1007-1733(2013)09-0011-03

2013–07–25）

*通讯作者