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卵黄和十二烷基硫酸钠添加量对犬精子冻后活率的影响

2016-09-05李祥平

兽医导刊 2016年14期
关键词:活率细管硫酸钠

李祥平

(1.天津药物研究院新药评价有限公司,天津 300301;2.天津农学院,天津 300301)

卵黄和十二烷基硫酸钠添加量对犬精子冻后活率的影响

李祥平1,2

(1.天津药物研究院新药评价有限公司,天津300301;2.天津农学院,天津300301)

本试验以Trjs-葡萄糖稀释液为基础稀释液,就卵黄(20%、25%、30%)和十二烷基硫酸钠(SDS)的添加量(0.725 mg/ml、1.000 mg/ml、1.500 mg/ml)对犬精子冻后活率的影响进行了研究。试验结果表明,(1)20%的卵黄添加量组犬精子的冻后活率最高。25%卵黄添加量组和30%卵黄添加量组比较则没有明显差异(F<F0.05)。(2)添加SDS与对照组比较,添加SDS组的精子冻后活率都较高。三种SDS添加量中,1.000 mg/ml的添加量效果最好,冻后精子活率极显著(F>F0.01)或显著(F>F0.05)高于添加量为0.725 mg/ml和1.500 mg/ml时的冻后精子活率。

犬精子;冷冻;卵黄;十二烷基硫酸钠

1 材料和方法

1.1实验动物

雄性德国牧羊犬一只,6岁,体况中等,身体健康,精液品质较好。

1.2实验器械和试剂

1.2.1实验器械

集精杯、恒温恒湿、培养箱、离心机、显微镜、电子天平、细管精液冷冻仪。

1.2.2实验试剂

Tris、柠檬酸、葡萄糖、丙三醇、十二烷基硫酸钠、卵黄

1.2.3稀释液配方

(1)基础稀释液(Tris-葡萄糖稀释液)

Tris 3.04%,柠檬酸1.7%,葡萄糖1.25%,双蒸水配置。

(2)稀释Ⅰ液(V/V)

试验一:80%基础稀释液 + 20%卵黄;

75%基础稀释液 + 25%卵黄;

70%基础稀释液 + 30%卵黄。

试验二:80%基础稀释液 + 20%卵黄;

80%基础稀释液 + 1.45mg/ml SDS + 20%卵黄;

80%基础稀释液 + 2mg/ml SDS + 20%卵黄;

80%基础稀释液 + 3mg/ml SDS + 20%卵黄;

(3)稀释Ⅱ液(V/V)

90%稀释Ⅰ液+10%甘油。

1.3实验方法

1.3.1公犬保定

双腿夹住颈部保定。

1.3.2人工按摩采精

采精者左手握住阴茎向后推包皮使球体露出,反复按摩球体。当犬的尾部和后肢出现摆动时,右手握住集精杯准备接精,收集精液的中间部分。

1.3.3鲜精品质评定

采出的精液要检查色泽、气味、射精量、精子活力和密度等。

1.3.4鲜精的处理、降温及平衡

将鲜精装入塑料试管中,用记号笔标注精液的体积,以1500rpm离心5min,弃掉上清液,加入基础稀释液至试管标线处,混合后以同样的方法进行二次离心,弃上清液,加入适量的与鲜精等温的稀释Ⅰ液进行稀释并混匀。棉塞封口,放入盛有400ml30℃热水的500ml烧杯中,4℃冰箱中降温。18h后,将等体积的已预冷至4℃的稀释Ⅱ液缓慢加入精液中,混匀后放回4℃冰箱,平衡4h。

1.3.5冻前准备和冷冻

(1)冻前准备

(1)冻前检查精子活率,并记录。

(2)测量液氮面高度。

(3)细管冷冻插座预冷:使温度降为-70℃。

(4)装管。

(2)冷冻

将装有精液的细管插入已预冷的细管冷冻插座内,立即放入液氮罐内液面上方要求的高度进行熏蒸,10min后提出细管冷冻插座,取出细管,立即放入冷冻提筒内投入液氮。

(3)解冻和冻后精子活率的检查

从液氮中取出细管,放入70℃的水中7秒进行解冻。解冻后在400倍镜下进行精子活率判定。

1.4实验结果统计

实验数据按单因子试验进行统计分析,并按F检验进行显著性检验。

2 实验结果

2.1卵黄添加量对犬精子冻后活率的影响

表1 卵黄添加量对犬精子冻后活率的影响

从表 1 看,三种卵黄添加量组中,20%的卵黄添加量组犬精子的冻后活率最高,极显著优于25%卵黄添加量组和30%卵黄添加量组(F>F0.01)。25%卵黄添加量组和30%卵黄添加量组比较则没有明显差异(F<F0.05)。

2.2十二烷基硫酸钠添加量对犬精子冻后活率的影响

表2 十二烷基硫酸钠(SDS)添加量对犬精子冻后活率的影响

从表 2 试验结果来看,与对照组比较,添加SDS组的精子冻后活率都较高。其中,SDS添加量为1.000 mg/ml和1.500 mg/ml时,冻后精子活率极显著(F>F0.01)或显著(F> F0.05)高于对照组。

3 讨论

3.1卵黄对犬精子冻后活率的影响

卵黄能维持稀释液的胶体渗透压,保护精子质膜和顶体膜免遭阳离子肽损害[1][2]。为了提高犬精子的冻后活率,我们对卵黄添加量进行了进一步研究。从表1试验结果来看,卵黄添加量以20%为最好,冻后活率明显好于卵黄添加量为25%和30%时的冻后活率。这与大多数研究报道和生产实践中常用20%的卵黄添加量相吻合。为什么增加卵黄添加量精子的冻后活率反而出现下降,可能因为卵黄添加增加使稀释液中其它成分的浓度降低所致。

3.2SDS对犬精子冻后活率的影响

1972年Graham等人[3]首先报道了在精子稀释液中添加Orvus ESPaste(氨基-钠-十二烷基硫酸脂,OEP)可以减少冻融过程对精子的损伤。

由于OEP含有SDS,所以本试验直接选用SDS就其对犬精子冻后活率的影响进行了研究。从表2试验结果来看,精液稀释液中添加SDS确实能够提高冻后犬精子的活率。

4 结论

(1)三种卵黄添加量中,20%的卵黄添加量冷冻效果最好,冻后精子活率极显著高于卵黄添加量为25%和30%时的冻后精子活率。

(2)SDS添加量为1.000 mg/ml和1.500 mg/ml时,冻后精子活率极显著(F>F0.01)或显著(F>F0.05)提高。三种SDS添加量中,1.000 mg/ml的添加量效果最好。

[1]Cardoso RDS etal Cryopreservation of canine semen using a coconut water extender with eggyolk and three different glycerol concentrations[J].Therio -genology,2003,59(3-4):743-751.

[2]潘寿文,刘湖,马大君.犬的精液冷冻技术.畜牧与兽医[J],1986 (3):105-106.

[3]Graham C D,Graham E F.Some factors influencing the freezing of boar spermatozoa[M].In:Proceeding of theSeventh International Congress on Animal Reproduction.MunichⅡ,1972:1627-1632.

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