李恒，孙夏冰，陆震鸣，3，王松涛，沈才洪，许正宏，，3，史劲松，

1(江南大学 药学院，江苏无锡，214122)2(国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州，646000)3(中国科学院天津工业生物技术研究所天津市工业生物系统与过程工程重点实验室，天津，300308)

我国浓香型白酒的生产以泥窖窖池为基础，以窖泥为关键材料［1－2］。窖泥是受人为活动影响较大的一类特殊土壤，其老熟程度直接影响着曲酒的质量［3］，其中含有丰富的己酸菌，发酵过程中能够产生大量的己酸，进而与乙醇反应生成浓香型大曲酒的主体香——己酸乙酯［2，4］。

千百年来，浓香型白酒的酿造以传统工艺的传承为主，其生产过程的质量控制主要依靠经验，对窖泥质量的鉴定长期以来主要依靠感官鉴定以及一些理化指标的分析数据［2］，如对窖泥中的氮、磷、钾等元素的分析［3］，以及发酵过程中的温度、水分、还原糖等含量的测定［5］。传统的分析方法受分析仪器的限制，仅仅能够获得窖池中部分物质成分的信息，对于许多风味化合物，尤其是微量物质无从获知，严重制约了我国传统白酒行业的健康发展。现代分析技术的发展大大促进了有关窖泥中的挥发性化合物、有机酸、氨基酸、脂肪酸等风味物质的分析研究，包括气质联用、液质联用、毛细管电泳等。这些仪器分析技术为研究传统发酵食品中的风味化合物提供了有力的分析手段，且灵敏度高、重复性好、信息量大、分析速度快［6－7］。固相微萃取(SPME)的出现，进一步提高了对于窖泥这类复杂基质中挥发性化合物的检测精度。SPME技术是一种快速分析技术，集样品预处理、吸附萃取等于一身，所需样品量微量，分析时间短，非常适合于白酒以及白酒生产过程中的微量成分的检测分析、过程监控等［2］。目前，顶空固相微萃取(HS-SPME)与气相色谱-质谱(GC-MS)联用的方法已成功应用于白酒等饮料中挥发性组分的分析［8－10］。

泸州老窖是浓香型白酒的典型代表，其产品独特风味的形成主要是窖泥中多种微生物共同作用的结果［11］。已有学者对窖泥中微生物的群落结构［12］、风味物质的组成［13］、不同窖龄老窖生产白酒的风味差异［7，12－13］等进行了研究报道。上述研究对窖泥挥发性物质的分析主要采用传统的溶剂萃取法，检测到的化合物种类有限。此外，现有研究多关注于窖池窖龄对于白酒风味的影响，很少关注窖池内部的空间位置可能对风味物质组成产生的影响。本研究建立了HS-SPME/GC-MS法用于窖泥挥发性化合物的分析，并分析了窖池中不同部位窖泥挥发性成分的差异以及对风味物质形成的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

窖泥样品分别取自泸州老窖50年窖龄窖池的窖壁与窖底。

Finnigan TRACE GC-MS，美国 Finnigan公司;SPME萃取头、手动进样手柄，美国Supelco公司;顶空进样瓶，中国安谱公司。

1.2 实验方法

1.2.1 窖泥样品及其前处理

取0.5 g窖泥放入顶空瓶中，加入5 mL煮沸10 min并冷却至室温的蒸馏水与2 g NaCl，再加入2 μL的2-辛醇(1.64 g/L)作为内标，旋紧瓶盖。

1.2.2 顶空固相微萃取(HS-SPME)条件

将装有窖泥样品的顶空瓶置于55℃水浴锅中，用固相 CAR/PDMS(75 μm CAR/PDMS，碳分子筛/聚二甲基硅烷)萃取纤维头插入硅胶塞，于50℃插入窖泥样品的饱和NaCl样品中顶空吸附30 min，于250℃解吸1 min后进行GC-MS分离鉴定。

1.2.3 气相色谱-质谱(GC－MS)分析条件

气相色谱条件:色谱柱:PEG 20M毛细管柱(Φ 0.25 mm × 0.25 μm × 30 m);载气:氦气，1.0 mL/min;程序升温条件:40℃维持3 min，5℃/min升温至60℃，10℃/min升温至230℃，维持8 min。

质谱条件:电离源温度:200℃;电离电势:70 eV;离子化模式:EI+;放射电流:200 μA;检测电压:350 V。

1.2.4 定性方法

物质定性利用GC-MS Postrun Analysis软件完成，未知化合物经计算机检索的同时与NIST08谱库和NIST08s谱库的相匹配，匹配度大于95%的鉴定结果才予以确认。

2 结果与讨论

2.1 窖泥中挥发性化合物的种类及比例

采用HS-SPME与GC-MS联用的方法检测泸州老窖50年窖龄窖池中窖壁窖泥与窖底窖泥中的挥发性组分，其总离子流图谱如图1所示，详细分析结果与统计结果分别见表1与图2。

从泸州老窖50年窖龄窖池的窖泥中共检测出65种挥发性化合物，其中窖壁窖泥53种，窖底窖泥49种。这些挥发性组分主要分为5大类，包括酯类、醇类、酸类、醛酮类及酚类化合物。窖壁窖泥中五大类挥发性组分占总峰面积的98.45%，其中，醇类化合物12种，占总峰面积的24.52%，酸类化合物5种，占总峰面积的17.24%，酯类化合物22种，占总峰面积的51.58%，醛酮类化合物9种，占总峰面积的4.09%，酚类化合物3种，占总峰面积的1.02%;窖底窖泥中五大类挥发性组分占总峰面积的97.63%，其中，醇类化合物14种，占总峰面积的29.35%，酸类化合物1种，占总峰面积的0.85%，酯类化合物17种，占总峰面积的59.82%，醛酮类化合物11种，占总峰面积的6.17%，酚类化合物3种，占总峰面积的1.44%。

图1 GC/MS分析50年窖龄的窖池中不同部位窖泥中的主要挥发性组分总离子流图(含内标)Fig.1 The total ionic chromatogram of main volatile constituents in the pit muds from different parts of Luzhou Laojiao cellar with 50 years using GC/MS method(with the internal standard)

2.2 不同部位窖泥中主要挥发性化合物的差异分析

2.2.1 醇类化合物

醇类化合物由微生物作用于糖、果胶质、氨基酸等物质而产生，是酒体中微量香味物质的基本组成部分［14］，在窖泥的挥发性成分中含量仅次于酯类化合物(图2)。由分析结果可知，窖泥中的醇类化合物主要由乙醇和一些高级醇(C4～C10)构成，且窖壁窖泥与窖底窖泥中醇类化合物的种类相差不大。窖底窖泥中醇类化合物的相对含量高于窖壁窖泥约5%，主要是由乙醇和1-己醇这两种含量最多的醇类化合物的差异所引起，窖底窖泥中的乙醇与1-己醇的相对含量分别比窖壁窖泥中高出1.22%和2.17%。

醇类化合物同时也是其他香味成分的基础，可进一步转化生成酸类、酯类等呈香呈味物质。

2.2.2 酸类化合物

在本实验所分析的50年窖龄的窖泥样品中，酸类化合物是存在显著差异的一类挥发性组分。从窖壁窖泥中共检测出丁酸、戊酸、己酸、己酸酐以及氢化肉桂酸5种酸类化合物，而窖底窖泥中仅检测到己酸的存在。此外，作为酸类化合物的主要成分，己酸在窖壁窖泥与窖底窖泥中的分布存在显著区别。窖壁窖泥中的己酸含量高达16.20%，占酸类化合物总量的93.97%，是窖底窖泥中含量的19.0倍。

表1 泸州老窖50年窖龄窖池中窖泥所含的挥发性化合物组成Table 1 The volatile constituents in the pit muds from different parts of Luzhou Laojiao cellar with 50 years

图2 50年窖龄窖池中窖泥中的挥发性组分及比例Fig.2 The composition and proportion of the volatile compounds in the pit muds from different parts of Luzhou Laojiao cellar with 50 years

己酸的主要产生途径是在己酸菌与甲烷菌偶联作用下，通过乙醇氧化生成乙酸，乙醇再进一步与丁酸作用生成己酸［15］。由窖壁窖泥中己酸的含量数据可直接推测，窖壁窖泥中含有大量的己酸菌与甲烷菌;而对于窖底窖泥，结合其酯类化合物中同样存在大量己酸酯类化合物的分析结果，可以说明窖底窖泥中同样存在大量的己酸菌与甲烷菌，但产生的己酸全部用于酯类化合物的生成，没有过量积累。

2.2.3 酯类化合物

酯类化合物是窖泥中含量最高、种类最多的挥发性组分，是对白酒风味影响最大的主体物质。其生成途径主要有两条，一是通过一些生香酵母(如汉逊酵母、假丝酵母等)体内的酯化酶作用产生，二是通过缓慢的酯化反应而产生。50年窖龄的窖泥样品中酯类化合物的相对含量占挥发性化合物总量的一半以上，说明窖泥中存在大量可进行酯化作用的微生物菌群［14］。

乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯以及已酸乙酯这“白酒四大酯”在窖泥样品中均可检测到，其中乳酸乙酯含量很低，在窖底窖泥中没有检测到。乙酸乙酯与己酸乙酯是窖壁窖泥与窖底窖泥的共同主体酯类，占酯类化合物总量的一半左右。

进一步比较窖壁窖泥与窖底窖泥中的酯类化合物发现，己酸酯种类最多，其中窖壁窖泥中有8种，窖底窖泥中有4种。此外，己酸酯的含量也存在显著差异。窖壁窖泥中含有2.43%的己酸丁酯与8.40%的己酸己酯，分别是窖底窖泥中相应成分的18.7倍与15.8倍;而窖底窖泥中则含有大量的己酸甲酯，含量高达23.79%，是窖壁窖泥的22.7倍，与醇类化合物分析数据联系起来可以推测，窖底窖泥中含有一定量的可水解利用果胶质原料的微生物［16］，水解产生的甲醇与己酸酯化进而生成己酸甲酯。

2.2.4 醛酮类化合物

醛类化合物对浓香型酒的香气起到一定的作用，但风味阈值低，含量过高容易造成苦味［17］。由分析结果可知，醛酮类化合物在窖泥中的含量较低，分别占窖壁窖泥与窖底窖泥中挥发性组分的4.09%与6.172%，主要是壬醛、癸醛、辛醛、2-戊酮等高级醛酮化合物。

2.2.5 酚类化合物

酚类化合物主要来自于蛋白质、木质素等的分解产物，含量很少，但呈香作用明显，在含量极低的情况下，也能呈现出强烈的香味［14］。检测到的酚类化合物有3种，包括苯酚、对甲基酚和2，4-二叔丁基苯酚，在窖壁窖泥与窖底窖泥中的含量差异较小。

3 结论

以泸州老窖50年窖龄窖池为研究对象，采用HS-SPME与GC-MS联用的方法，检测窖壁窖泥与窖底窖泥中的挥发性物质的组成，并进行差异分析。从窖池窖泥中共检测出65种挥发性化合物，其中窖壁窖泥53种，窖底窖泥49种。这些挥发性组分主要是酯类、醇类、酸类、醛酮类及酚类化合物。窖壁窖泥与窖底窖泥中的醇类、醛酮类以及酚类化合物差异不大，而酸类与酯类化合物无论在种类还是数量上均存在显著差异。

窖壁窖泥中检测到以己酸为主成分的5种酸类化合物，而窖底窖泥中仅检测到己酸的存在。窖壁窖泥中的己酸含量高达16.20%，是窖底窖泥中含量的19.0倍。酯类化合物是窖泥中含量最高、种类最多的挥发性组分，在窖壁窖泥与窖底窖泥中的相对含量分别达到51.58%和59.82%，其中，乙酸乙酯与己酸乙酯是窖壁窖泥与窖底窖泥的共同主体酯类;己酸酯的种类与含量存在显著区别，窖壁窖泥中含有2.43%的己酸丁酯与8.40%的己酸己酯，分别是窖底窖泥中相应成分的18.7倍与15.8倍;而窖底窖泥中则含有23.79%己酸甲酯，是窖壁窖泥的22.7倍。

本研究建立了HS-SPME/GC-MS法用于检测窖泥中挥发性组分的分析方法，分析了窖池中不同部位窖泥挥发性成分的差异以及对风味物质形成的影响，为进一步理解白酒中风味物质的形成机理，更好地揭示窖泥与风味的关联提供参考。

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