王晓哲 钱 方 曹 迪 牟光庆 姜淑娟

WANG Xiao-zhe QIAN Fang CAO Di MU Guang-qingJIANG Shu-juan

（大连工业大学食品学院，辽宁 大连 116034）

(College of Food Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian,Liaoning 116034,China)

牛乳含有能促进人类生长发育以及维持健康水平的必需营养成分，是一种重要的饮食资源[1]。但由于牛乳中乳糖不易被消化、吸收，极易引发乳糖不耐受现象。部分人群存在乳糖不耐症，是由于体内缺乏乳糖酶，食用乳或乳制品后会引发肠胀、排气增多、腹泻、腹痛等非疾病性胃肠症状。据调查，亚洲人口中约有70%人群患有不同程度的乳糖不耐症，在美国也有1/3人群体内乳糖酶水平较低。研究[2，3]显示中国成年人饮用牛奶后乳糖不吸收的发病率高达86.7%，不耐受指数为0.9。生产提供低乳糖乳是解决乳糖不耐问题的有效途径。低乳糖乳在国外已商业化生产，在中国则刚起步。低乳糖乳的生产方式有多种，其中酶水解法生产是最具安全性、实用、有效的方法，且生产成本低，对拓展低乳糖乳的产业化生产有着很强的优势[4-6]。通常低乳糖乳中乳糖水解率可达到70%～90%，是乳糖不耐受患者的最佳食品。它既能满足该人群的营养需求，又能消除他们饮用牛乳后所产生的不适症状[7]。另外，由于低乳糖牛乳中乳糖酶解产生葡萄糖和半乳糖两种单糖，虽牛乳甜度增加，但总糖量并不改变，这样便可解除乳糖不耐症患者不能喝牛乳的苦恼。所以，低乳糖牛乳是集营养和美味于一身的健康食品，满足了这部分人群的乳品消费的需求[8]。本试验拟设计合理的低乳糖牛乳生产工艺，进一步确定其最佳酶解条件，使乳糖达到最大限度水解。

1 材料与仪器

1.1 材料

纯牛奶：内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司；

醋酸铅：天津市津科精细化工研究所；

ONP（邻硝基酚）：分析纯，沈阳市试剂三厂；

ONPG（邻硝基苯酚-β-D半乳糖苷）：光学纯，美国Solarbin公司；

乳糖酶：592.20 U/mL，丹麦Novozymes公司。

1.2 仪器

光栅分光光度计：722型，山东高密彩虹分析仪器有限公司；

数控超级恒温槽：SC-15型，宁波天恒仪器厂；

手提式不锈钢高压杀菌器：YX280A型，上海惊鸿实验设备有限公司；

电子天平：PL303型，梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 低乳糖牛乳的工艺流程

原料乳验收→预处理→标准化→巴氏杀菌 (65℃，30 m in)→冷却→添加乳糖酶→水解→灭酶杀菌→灌装→成品[9,10]

1.3.2 乳糖酶活力测定 采用ONPG法[11]。

1.3.3 乳糖量及水解度测定 采用碘量法[12]。

1.3.4 单因素分析乳糖酶的适宜水解条件

(1)适宜水解温度的确定：将牛乳和适当酶液分别在30，35，40，45，50 ℃下预热 10min，控制乳糖酶量 2 000 U/L，水解0.5 h后灭酶，通过测定乳糖水解率（平行2次）确定乳糖酶的适宜水解温度。

(2)适宜加酶量的确定：水解温度采用1.3.4(1)中确定的适宜水解温度。分别以终浓度 500，1 000，1 500，2 000，2 500，3 000 U/L添加乳糖酶液，水解0.5 h后灭酶，通过测定乳糖水解率（平行2次）确定乳糖酶的适宜加酶量。

(3)适宜水解时间的确定：水解温度和加酶量采用1.3.4(1)和(2)中确定的适宜值，分别水解牛乳 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h后灭酶，通过测定乳糖水解率（平行2次）确定乳糖酶的适宜水解时间[13，14]。

1.3.5 正交试验优化乳糖酶水解条件 考虑到乳糖酶不同水解因素间的交互作用，设计L9（34）正交表，以乳糖酶水解率为指标，考察水解温度、水解时间和加酶量3因素（分别以A、B、C表示）对乳糖酶效果的影响。

2 结果与讨论

2.1 单因素分析乳糖酶的适宜水解条件

2.1.1 水解温度的确定 由图1可知，酶解温度在30～40℃时，乳糖水解率随着酶解温度的增加而增大，当酶解温度达到40℃时，水解率达到最大值；在40～50℃时，随着酶解温度的增加，水解率反而下降。这是因为，酶解温度过高时，乳糖酶稳定性较差并且已部分失去活性，不能充分的水解乳糖。因此确定乳糖酶酶解的最适温度为40℃。

图1 温度对乳糖水解的影响Figure 1 Effects of different temperature on lactose hydrolysis

2.1.2 加酶量的确定 由图2可知，当加酶量为500～2 500U/L时，乳糖水解率随着加酶量的增大而逐渐增大，当加酶量继续增大时，水解率变化很小且趋于稳定，这是因为牛乳中乳糖随着乳糖酶量的增加，由原来的过量逐渐达到饱和。因此，选择2 500 U/L为最适加酶量，此时乳糖水解率为32.14%。

图2 加酶量对乳糖水解率的影响Figure 2 Effects of differentenzyme dosage on t lactose hydrolysis

2.1.3 水解时间的确定 由图3可知，随着酶解时间的延长，低乳糖牛乳中乳糖的水解率也随之增大；酶解0.5～2.5 h时，水解率随着时间的延长而增加；酶解2.5 h时，水解率达到65.71%。考虑到产品在酶解时间进一步延长时，可能会导致生产过程的污染，从而影响低乳糖牛乳的产品质量。因此，确定乳糖酶的最适酶解时间为2.5 h。

图3 酶解时间对乳糖水解的影响Figure3 Effectsofdifferentenzymolysis time on lactosehydrolysis

2.2 正交试验优化乳糖酶水解条件

考虑到乳糖酶不同水解因素间的交互作用，采用三因素三水平L9（34）的正交试验，来优化低乳糖牛乳中乳糖的最佳水解条件。正交试验的因素水平见表1，结果与分析见表2。

通过正交试验结果分析（表2）可以看出最优组合为A2B2C3，即水解温度40℃、水解时间3 h、加酶量2 500 U/L。这时牛乳中的乳糖水解率最高，达到75.00%。通过正交试验极差比较可以看出，低乳糖牛乳中乳糖酶水解因素对水解率的影响效果大小为A＞B＞C，即水解温度＞加酶量＞水解时间。

表1 乳糖酶水解牛乳的因素水平表Table1 Factor level tableof lactoseenzymehydrolysismilk

表2 乳糖酶水解牛乳正交试验L9（34）结果分析Table2 L9(34)orthogonal test resultanalysis of lactose enzyme hydrolysis

对试验结果进行方差分析（表3），并进行显著性检验。可知，FA＞FB＞FC。而且 FA＞F0.01(2,2)，这说明对于低乳糖牛乳中乳糖水解率来说，水解温度为极其显著因素；而F0.05(2,2)＜FB＜F0.01(2,2)，说明加酶量为一般显著因素，FC＜F0.05(2,2)，说明在上述水解时间内，水解时间对水解度没有显著性影响，可选取较短酶解时间。

进一步对上述正交优化结果进行验证实验，分别在水解时间为2 h和3 h时测定低乳糖牛乳中乳糖的水解率，结果分别是74.50%和75.00%，水解率的增幅不是很大，考虑到实际生产，为缩短生产时间、降低成本和避免染菌，试验选取水解时间为2 h，此时水解率为74.50%。因此，确定最优工艺条件为水解温度40℃、加酶量2 500 U/L、水解时间2 h。

表3 乳糖酶水解牛乳正交试验L9（34）方差分析表Table3 Orthogonal test L9(34)analysis of variance table of lactose enzyme hydrolysismilk

3 结论

本试验设计了低乳糖牛乳的生产工艺，并通过单因素分析和正交试验研究确定了牛乳的最佳水解条件：在加酶量2 500 U/L、水解温度40℃、水解2 h时牛乳中乳糖水解效果最佳，水解率达到74.50%。此研究解决了乳糖不耐症患者不能喝牛乳的苦恼，而且在乳糖酶解过程中也产生了单糖[15]，增加了牛乳的甜度。

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