李佳，刘红燕，刘谦，张永清

(山东中医药大学，山东 济南 250355)

甜地丁为我国民间传统药材，来源于豆科植物米口袋(G.verna(Geogri)A.Bor.)的干燥全草［1］，具有清热解毒、凉血消肿的功能，临床用于治疗疔疮、痈疽及一切化脓性炎症，主要含有黄酮、萜、挥发油、甾醇及有机酸等成分［2］。药理研究［3－4］表明，甜地丁黄酮具有抗氧化活性。黄海兰等［4］对甜地丁乙酸乙酯提取物清除自由基活性成分进行了追踪，得到槲皮素－3－O－葡萄糖苷、芹菜素和4′，7－二羟基黄酮3种黄酮类成分，发现其清除自由基活性的大小主要取决于酚羟基的数目，抗氧化活性顺序为槲皮素－3－O－葡萄糖苷＞芹菜素＞4′，7－二羟基黄酮，进一步阐明了其抗氧化活性能力与其特殊结构有关。但关于其提取工艺及与抗氧化活性相关性分析未见报道。为此，本文对甜地丁黄酮提取工艺及清除羟自由基、超氧阴离子自由基的抗氧化活性进行了研究，以期为该味药材黄酮类成分的药理活性研究及天然食品抗氧化剂的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

米口袋(G.verna(Geogri)A.Bor.)采自山东长清，晒干后粉碎，过60目筛，备用。

1.1.2 试剂

芦丁标准品(济南市药检所提供)，1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH，Sigma 公司，批号:S43654－357)，试剂均为分析纯;蒸馏水(自制)。

1.1.3 仪器

721型紫外－可见分光光度计;FA1104型电子天平(上海天平仪器厂);HH－S4双孔四列电热恒温水浴锅(北京科伟永鑫仪器厂);101－(1)A数显式电热恒温干燥箱(上海阳光实验仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 甜地丁总黄酮的提取工艺

粉碎后的干燥甜地丁→加石油醚→索氏提取除脂→抽滤得滤渣→乙醇回流提取总黄酮→浓缩滤液→75%乙醇溶液定容。

1.2.2 标准曲线绘制

精密称取60℃干燥至恒重的芦丁对照品5.10mg，置50mL量瓶中，用80%乙醇溶解稀释并定容至刻度。精密量取 0、1、2、3、4、5、6、7 mL 分别置于 10mL 容量瓶中，加 0.72 mol/L 的 NaNO2溶液 0.3 mL，摇匀，放置6 min;加入0.47 mol/L的Al(NO3)3溶液0.3 mL，振摇，放置6 min;再加入1 mol/L的NaOH 溶液2 mL，振摇并加水至刻度，放置15 min。全波长扫描发现510 nm处有最大吸收峰，在510 nm处测吸光度，得回归方程:A=0.0106C －0.0003(r=0.9993，n=7)，表明对照品在 10.20 ～71.40 μg/mL 范围内呈良好线性。

1.2.3 正交试验分析

在单因素实验研究的基础上，利用正交试验，进一步优化提取工艺，条件如表1所示。

表1 正交试验提取工艺的因素水平表Table1 Factor levels of the extraction technology of orthogonal array design

1.2.4 总黄酮含量测定

样品各精密称取5份，每份约0.5 g，按最佳提取工艺制备样品供试液，含量测定按1.2.2方法进行，计算总黄酮含量。

1.2.5 总黄酮体外抗氧化活性研究

采用Fenton体系和邻苯三酚自氧化法，对最佳条件下提取的总黄酮体进行外抗氧化性测定。

1.2.5.1 甜地丁总黄酮对·OH清除实验

Fenton反应体系是用来产生羟自由基(·OH)最常用的体系［5］，而·OH清除率是反映物质抗氧化作用的重要指标。实验方法参照文献［6］。

1.2.5.2 清除超氧阴离子自由基(O2－·)的活性

参照文献［7］采用邻苯三酚自氧化法在299 nm处测定样品对O2－·的清除能力，计算清除率。

1.2.6 甜地丁总黄酮与抗氧化活性相关性分析

以羟自由基清除率(X1)、超氧阴离子自由基清除率(X2)为横坐标，甜地丁总黄酮量(Y)为纵坐标，采用SPSS16.0对实验结果进行线性回归考察。

2 结果与分析

2.1 正交试验结果分析

由实验结果可知乙醇浓度和提取次数对总黄酮提取率有显著影响，影响程度依次为A＞D＞C＞B。考虑到实际情况，确定最佳提取工艺为A2D3B1C1，即20倍量75%乙醇，提取4次，提取时间为30min。在此条件下的总黄酮得率为3.423%，RSD=0.16%(n=3)。

表2 正交试验及结果分析Table 2 Orthogonal experiment and its result analysis

2.2 体外抗氧化活性研究

甜地丁总黄酮对·OH和O2－·的清除能力随浓度的增大而增大，在浓度为45.6 μg/mL时达到最大值，表明甜地丁总黄酮对·OH和O2－·清除能力与浓度呈较明显的量效关系(图1)。

2.3 甜地丁总黄酮与抗氧化活性相关性分析

图1 总黄酮对·OH和O2－·的清除作用Fig.1 Scavenging effects of total flavonoids to ·OH and O2－·

表3 回归系数及显著性检验表Table 3 Regression coefficient and significance analysis table

图2 回归标准残差正态P-P图Fig.2 Normal plot of regression standard residuals

把总黄酮量(Y)作为因变量，X1、X2作为自变量带入回归方程进行全回归。总体参数如下:相关系数为0.944，决定系数为0.890，反映了总体回归效果较好;方差显著性检验结果显示F=12.183，P＜0.05，回归标准残差正态P-P图(图2)显示自变量(Xn)与因变量(Y)服从正态分布，证明甜地丁总黄酮含量与抗氧化活性之间存在显著的线性关系。进而对其进行多元线性回归分析，得到回归系数分析表(表3)。由表3得拟合方程:Y= －18.626+2.314X1+0.514X2，标准化后，拟合方程:Y= －18.626+0.726X1+0.228X2。

4 讨论

黄酮类化合物是一种天然的抗氧化剂，具有抗衰老、增强机体免疫力等多种生理活性，且具有高效、低毒的优点，是近年来众多学者研究的热点。其抗氧化作用机制主要与其特殊结构有关，可以通过与金属离子发生相互作用而具有抗氧化活性［8］，还可通过酚羟基与自由基进行抽氢反应生成稳定的半醌自由基，中断链式反应［9－10］而具有抗氧化活性。

本实验采用正交试验设计，对甜地丁中总黄酮的提取工艺进行了优化，并对其体外抗氧化活性进行了评价，结果表明，甜地丁总黄酮具有良好的清除·OH和O2－·的能力，表现出良好的体外抗氧化活性。由于甜地丁来源丰富，且属于无毒无副作用的天然产物，故将其作为抗氧化剂开发将会具有广阔的前景。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［M］.北京:化学工业出版社，2000:附录Ⅲ.

［2］段旭静，李佳，张永清.米口袋属药用植物研究［J］.山东中医药大学学报，2010，34(2):181－183.

［3］TSUNODA Y，OKAWA M，KINJO J，et al.Studies on the constituents of Gueldenstaedtia multiflora［J］.Chem Pharm Bull Tokyo，2008，56(8):1138 －1142.

［4］黄海兰，徐波.米口袋清除自由基活性及其成分的研究［J］.青岛大学学报:自然科学版，2006，19(4):30－35.

［5］荣建华，李小定，谢笔钧.大豆多肽抗氧化效果的研究［J］.食品科学，2002，23(11):118－120.

［6］寇巧花，吴雪辉，李丽，等.油茶籽壳粗提物的抗氧化活性研究［J］.食品研究与开发，2010，31(3):73－76.

［7］王兴，黄忠明，王莉，等.苦荞蛋白模拟消化产物抗氧化活性及组成研究［J］.中国食品学，2009，9(6):10－15.

［8］文美琼，李璐，杨申明.彝药野坝子花总黄酮的提取及对活性氧自由基的清除作用［J］.时珍国医国药，2010，21(6):1444－1445.

［9］张庆乐，吴守林，张丽青，等.植物黄酮在抑制亚硝化反应中的应用［J］.医药导报，2009，28(6):733－734.

［10］陈建真，吕圭源，叶磊，等.黄芪黄酮的化学成分与药理作用研究进展［J］.医药导报，2009，28(10):1314－1316.