胡旭昌，王栓科，康学文，张海鸿，汪 静，万 麟，安丽萍，刘文忠，马靖琳，王翠芳

骨肉瘤是最常见的人类恶性肿瘤，尽管应用化疗、放疗、手术治疗骨肉瘤在过去几十年取得了很大的进步，但并未显著提高本病的治愈率，尤其是多学科综合治疗后肺转移的问题，15%～25%的患者需重新化疗和切除转移灶[1-2]。吉西他滨具有广谱抗肿瘤活性[3]，对多种肿瘤细胞在体外表现出明显的细胞毒作用[4-5]。本研究通过观察吉西他滨对人骨肉瘤MG-63细胞株在体外的抗肿瘤作用，探讨其在抑制肿瘤细胞增殖及抑制人骨肉瘤细胞系肿瘤转移相关基因1(MTA1)mRNA表达的作用，为有效治疗骨肉瘤提供新的思路。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞来源人骨肉瘤细胞株MG-63购于中国科学院细胞库。

1.1.2主要试剂吉西他滨(哈尔滨誉衡药业股份有限公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，DMEM/F12(武汉博士德生物工程有限公司)，青霉素、链霉素(哈尔滨制药集团有限公司)，二甲亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma公司)，胰蛋白酶(Amresco公司)，Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)，RNA提取试剂盒(Invitrogen公司)，反转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒、实时定量试剂盒(Takara公司)。

PCR引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。人β-actin引物序列：上游引物5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′；人MTA1序列：上游引物5′-CGGCATCCATGCTGCTCTTA-3′，下游引物5′-ACTGGTCGATCTGCTTGTCTGTG-3′。

1.1.3主要仪器二氧化碳(CO2)细胞培养箱、台式低温高速离心机(Heraeus公司)，超纯水仪(USFELGA公司)，台式高速离心机(上海医用分析仪器厂)，超净工作台(江苏苏净集团有限公司)，磁力搅拌器(WerkeGmbHCOKG公司)，酶标仪(Hyperion公司)，荧光显微镜(Olympus公司)，85-2型恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器厂)，荧光定量PCR仪(Bioneer公司)。

1.2方法

1.2.1MG-63细胞的培养将人骨肉瘤MG-63细胞置于5%CO2、37 ℃培养箱中，常规培养于10%特级胎牛血清、双抗(青霉素100 U/ml和链霉素100 U/ml)的DMEM/F12培养基中培养。当培养皿中细胞铺至70%～80%时，在超净台内进行传代。

1.2.2MTT法检测吉西他滨对人骨肉瘤MG-63细胞增殖的影响将对数生长期的细胞接种于96孔板培养12 h后，细胞完全贴壁。然后加入含有不同浓度的吉西他滨(0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.400 mg/L)培养基和DMSO，置于培养箱中继续培养。作用24 h后停止干预，加入MTT，置于培养箱中培养4 h后中止，充分溶解结晶。用全自动酶标仪在570 nm检测各孔吸光度(A)值，实验重复5次，取平均值作为实验组A值。抑制率=1-实验组A值/空白对照组A值×100%，计算出标准差。

1.2.3RT-PCR测定MTA1 mRNA的表达选取对数生长期的人骨肉瘤MG-63细胞约0.5×106个，培养12 h后给予不同浓度的吉西他滨(0.100、0.200、0.400 mg/L)作用后，每个剂量组设3个复孔，设空白对照组。培养24 h后提取细胞RNA，反转录合成cDNA、PCR扩增目的基因。利用实时定量荧光PCR仪得到Ct值，通过以下换算方法得到实验组mRNA相对表达量：2-△△Ct，△△Ct=△CtT-△CtP=(CtT-CtTE)-(CtP-CtPE)，CtT、CtTE、CtP、CtPE分别为实验组Ct值、实验组平均Ct值、内参(β-actin)Ct值、内参平均Ct值。

2　结果

2.1吉西他滨对人骨肉瘤MG-63细胞增殖的影响不同浓度吉西他滨(0.025、0.050、0.100、0.200、0.400 mg/L)作用24 h后，人骨肉瘤MG-63细胞抑制率间差异有统计学意义(P<0.05)；其中0.025、0.050 mg/L组抑制率均低于其他3组，0.100、0.200 mg/L组亦低于0.400 mg/L组，差异有统计学意义(P<0.05，见表1)。

2.2吉西他滨对MTA1 mRNA表达的影响吉西他滨作用于人骨肉瘤MG-63细胞24 h后，经实时定量PCR检测，0.100、0.200、0.400 mg/L吉西他滨组MTA1 mRNA相对表达量分别为(0.86±0.16)、(0.68±0.12)、(0.46±0.08)，空白对照组MTA1 mRNA相对表达量为(1.01±0.15)，4组间差异有统计学意义(F=38.722，P=0.0093)；其中0.100、0.200、0.400 mg/L吉西他滨组MTA1 mRNA相对表达量均低于空白对照组，且3个剂量吉西他滨组MTA1 mRNA相对表达量依次降低，差异均有统计学意义(P<0.01，见图1)。

Table1Inhibition ratios of MG-63 cells treated with varying concentrations of gemcitabineon(after 24 h)

吉西他滨浓度(mg/L)MG-63细胞抑制率0 025　3 3±1 2　　　　　0 050　3 7±1 0　　　　　0 100　6 1±0 1∗△　　　0 200　8 0±1 9∗△　　　0 40011 5±1 4∗△▲☆F值30 568P值0 0169

注：与0.025 mg/L组比较，*P<0.05；与0.050 mg/L组比较，△P<0.05；与0.100 mg/L组比较，▲P<0.05；与0.200 mg/L组比较，☆P<0.05

注：1、2、3、4分别为空白对照组及0.100、0.200、0.400 mg/L吉西他滨组；MTA1=肿瘤转移相关基因1

图1不同浓度吉西他滨作用MG-63细胞后MTA1 mRNA的相对表达量

Figure1Effects of gemcitabineon on the mRNA expression of MTA1 in MG-63 cells

3　讨论

临床研究发现，吉西他滨能抑制骨肉瘤细胞生长，使细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡，并且可以与多西紫杉醇、卡铂等多种化疗药联合使用产生协同效应，增加抗肿瘤作用[6-7]；此外，其还可以增加放射治疗的效果[8]。细胞凋亡是细胞毒性药物治疗的一种主要方式，本研究结果显示吉西他滨对人骨肉瘤MG-63细胞的生长有抑制作用，并且呈剂量依赖性——0.025、0.050 mg/L吉西他滨作用24 h后，人骨肉瘤MG-63细胞抑制率均低于0.100、0.200、0.400 mg/L吉西他滨，且0.100、0.200 mg/L吉西他滨作用24 h后，人骨肉瘤MG-63细胞抑制率亦低于0.400 mg/L吉西他滨。有报道称吉西他滨对肿瘤细胞的增殖阻滞可能与p53、p21的表达有关[9]，也有研究认为吉西他滨诱导骨肉瘤细胞凋亡可能是通过Fas/FasL的死亡受体途径[10]。

骨肉瘤发生转移早，给临床治疗带来了很大困难，其最常见的转移部位是肺，这可能与肿瘤转移相关的基因表达有关。MTA1是一种肿瘤转移相关基因，其表达的增高与肿瘤转移有直接的相关性，在多种转移癌组织中都可检测出MTA1的高表达，如乳腺癌、胃癌、大肠癌等[11]。有研究表明，MTA1可以明显增加MG-63细胞株的侵袭能力[12]。本研究采用实时定量PCR检测人骨肉瘤MG-63细胞MTA1 mRNA的相对表达量，发现0.100、0.200、0.400 mg/L吉西他滨干预24 h后，人骨肉瘤MG-63细胞MTA1 mRNA相对表达量降低，从而证明吉西他滨可能通过降低MTA1 mRNA的表达来抑制骨肉瘤细胞的转移。故MTA1在抑制骨肉瘤转移基因治疗机制中的作用值得进一步研究[13]。

综上所述，吉西他滨能抑制人骨肉瘤MG-63细胞增殖，且有剂量依赖性；其作用机制可能是通过抑制MTA1 mRNA的表达，从而抑制MG-63细胞转移。这为骨肉瘤的治疗提供了新的可能。

1Rodriguez CO Jr，Crabbs TA，Wilson DW，et al.Aerosol gemcitabine：preclinical safety and in vivo antitumor activity in osteosarcoma-bearing dogs[J].Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery，2010，23(4)：197-206.

2Jaffe N.Osteosarcoma：review of the past，impact on the future.The American experience[J].Cancer Treat Res，2009(152)：239-262.

3Fox E，Patel S，Wathen JK，et al.Phase Ⅱ study of sequential gemcitabine followed by docetaxel for recurrent Ewing sarcoma，osteosarcoma，or unresectable or locally recurrent chondrosarcoma：results of Sarcoma Alliance for Research Through Collaboration Study 003[J].Oncologist，2012，17(3)：321.

4Ando T，Ichikawa J，Okamoto A，et al.Gemcitabine inhibits viability，growth，and metastasis of osteosarcoma cell lines[J].J Orthop Res，2005，23(4)：964-969.

5Huang P，Plunkett W.Fludarabine-and gemcitabine-induced apoptosis：incorporation of analogs into DNA is a critical event[J].Cancer Chemother Pharmacol，1995，36(3)：181-188.

6McMahon MB.Gemcitabine in combination with carboplatin exhibits biologic activity against canine osteosarcoma[D].Ohio State University，2009.

7Navid F，Willert JR，McCarville MB，et al.Combination of gemcitabine and docetaxel in the treatment of children and young adults with refractory bone sarcoma[J].Cancer，2008，113(2)：419-425.

8Anderson PM，Wiseman GA.Gemcitabine radiosensitization after153Sm-EDTMP(quadramet) bone-seeking radioisotope therapy for osteoblastic lesions of osteosarcoma：activity and principles[J].Journal of Clinical Oncology，2005，23(1 Suppl)：8534.

9Tolis C，Peters GJ，Ferreira CG，et al.Cell cycle disturbances and apoptosis induced by topotecan and gemcitabine on human lung cancer cell lines[J].Eur J of Cancer，1999，35(5)：796-807.

10Koshkina NV，Kleinerman ES.Aerosol gemcitabine inhibits the growth of primary osteosarcoma and osteosarcoma lung metastases[J].International Journal of Cancer，2005，116(3)：458-463.

11Li X，Chen A，Yi C，et al.Correlation between expression of the MTA1 gene and the invasion and metastasis in human osteosarcoma cells[J].China Oncology，2006，23(4)：546-548.

12Chengla YI，Xinzhi L，Weiguo X，et al.Relationship between the expression of MTA-1 gene and the metastasis and invasion in human osteosarcoma[J].J Huazhong Univ Sci Technology Med Sci，2005，25(4)：445-447.

13Lee MH，Na H，Kim EJ，et al.Poly(ADP-ribosyl) ation of p53 induces gene-specific transcriptional repression of MTA1[J].Oncogene，2012，31(49)：5099-5107.