王 荻，刘红柏

(中国水产科学研究院/黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 15007)

中草药具有天然、高效、毒副作用少、资源丰富、价格低廉等特点，同时兼有药用和营养的双重作用，既可调节动物的健康状况，提高水产动物性能和饲料利用率，又可改善机体的免疫机能，防治水产动物病害，是其他禁用抗菌素和化学药物的替代产品，在水产养殖应用中越来越受到人们的青睐［1］。

目前中草药作为免疫调节剂已逐步应用于水产养殖业，关于牙鲆［2］、镜鲤［3］、黄颡鱼［4］、异育银鲫［5］等各种水产动物应用效果的报道越来越多，但是关于鲟鱼方面的报道仍较少［6－8］，还需进行大量工作筛选适合于鲟鱼的中草药免疫调节剂。

随着我国鲟鱼人工繁殖、人工养殖技术的不断完善、推广，这种大型珍贵鱼类的养殖范围逐渐扩大，产量逐年递增，其产量及利润在我国淡水养殖业中所占比例日渐升高。因其独特的外貌体征，鲜嫩的肉质及丰富的营养含量，作为一种名特优鱼种，鲟鱼越来越受到高等餐桌的接纳和欢迎，在兼具生态价值、观赏价值的同时也具有极高的经济价值。

随着水产养殖业集约化、规模化发展，健康绿色养殖已成为现代渔业的必然发展方向，中草药作为一种绿色、健康、营养的免疫调节剂应用于水产动物病害防治已成为目前水产行业研究的热点。而目前国内关于鲟鱼用中草药添加剂的研究仍较少，且未见对运输、养殖过程中遇到的高温应激的调节方面研究的报道。本实验选取一种单方和两种复方，研究他们对施氏鲟常温及热刺激下特异性免疫功能的影响，为中草药在鲟鱼这一极具潜力的养殖品种的应用上提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

健康非免疫状态下1+龄施氏鲟(Acipenser schrenckii)由中国水产科学研究院鲟鱼繁育技术工程中心提供，平均体质量为 0.08 ～0.10 kg。

实验用中药均购自哈药集团世一堂药店，烘干粉碎后备用;溶菌酶测试试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

白细胞吞噬实验采用嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila，Ah)，所用菌株为实验室鉴定保存菌株。

1.2 实验方法

1.2.1 中药方剂及药液的制备 实验共选用一种单方及两种复方，单方为贯众，自组复方一由黄芪、党参、防风、柴胡等组成，复方二由当归、黄芪等组成。

各方剂按其配比称取中药，放入砂锅中，加水浸泡30min，第一次熬45min，将药汁倒出，再加水熬30min，过滤，将两次药汁合并浓缩成100mL，其中1mL药液相当于1 g中药方剂(干物质)的水煎剂，经高压灭菌后存放于冰箱(4℃)中备用。

1.2.2 实验鱼的饲养及样品采集 随机选取施氏鲟于室内水族箱(0.90 m×0.50 m×0.45 m)水温22℃下预饲两周，每组两个平行，各15尾鱼，保持各水族箱养殖条件均一，每天按鱼体质量的2.0%投喂全价基础饲料。

预饲结束后，按照贯众每50 kg体质量给药剂量为9 g，方一为175 g，方二为36 g，口灌连续给药两周。给药结束后，将半数鱼放入30℃的控温水族箱中热刺激2 h，然后与在正常水温22℃下的实验鱼一同取样。自实验鱼尾动(静)脉采血，低温静置后离心分离血清，并解剖取鱼鳃、肝、幽门毛囊、胃、肠等各组织样品，立即于－80℃下保存。

1.3 各项指标的测定

1.3.1 样品的处理 准确称取实验鱼组织样品与预冷的生理盐水按1∶9稀释，匀浆机充分匀浆，分别按不同检测指标及试剂盒所要求的速度和时间离心，取上清液进行检测。血清在37℃下水浴融化后即可检测。每个监测指标的样本数n=15，均设平行样。

1.3.2 生化指标的检测 采用Beckman公司生产的CYNCHRON CH4PRO全自动生化分析仪进行检测。检测指标包括:总蛋白、白蛋白、球蛋白、白球比例。

1.3.3 白细胞吞噬 复苏保存的嗜水气单胞菌菌株，37℃基础液体培养基摇菌18 h，将菌液水浴煮沸10min。参照王树芹等的方法［9］测定白细胞吞噬，采用公式如下:

1.3.4 溶茵酶含量的测定 施氏鲟血清及各组织溶菌酶测定方法参照刘红柏等［10］，溶菌酶的含量计算公式如下:

其中:Tt——水浴后吸光度At换算出的透光度;T0——水浴前吸光度A0换算出的透光度。

1.3.5 数据处理 各项酶活性值数据结果采用SPSS软件最小显著差数法(LSD)进行处理;生化指标采用SPSS统计软件中的单因子方差分析进行统计，邓肯氏法进行多重比较。

2 结果分析

2.1 施氏鲟血清中蛋白含量及白球比例的变化

对照组及实验组施氏鲟血清中总蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，ALB)、球蛋白(globulin，GLU)含量及白球比例(A:G)具体变化情况见表1。表中用高温标记热刺激组，下同。

表1 施氏鲟血清中TP、ALB、GLU含量及A:G比值的变化Tab.1 Content of TP，ALB，GLU and value of A:G in blood plasma of Amur sturgeon

由表2可见，TP和GLU最高值均出现在常温贯众组，而ALB及A∶G的最高值分别出现在高温贯众组和常温方一组。且4个组别之间TP和ALB均无显著性差异，而常温方一组的GLU含量显著低于常温贯众组，常温贯众组的A∶G比值显著低于常温方一组和常温对照组。且3种血清蛋白的最小值均出现在常温方一组。

2.2 施氏鲟白细胞吞噬功能的变化

对照组及实验组施氏鲟白细胞吞噬率PP见图1。由图1可见，PP的最大值和最小值分别出现在高温方一组和高温方二组，且对照及方一均表现为热刺激后PP升高，而方二和贯众组则降低。且方一和方二PP值受热刺激影响较大，但只有高温方一组显著高于其他所有组别(P＜0.05)，其余各组均未呈现显著性变化。

白细胞吞噬的细菌个数及吞噬指数PI见表2。由表2数据可见，各实验组吞噬细菌个数差别较大，吞噬最大值出现在高温贯众组为80个左右，而最小值高温方二组为49个左右。高温贯众组的吞噬指数显著高于方一组合常温贯众组。

图1 白细胞吞噬率变化Fig.1 Variety of neutrophil phagocytic rate

2.3 施氏鲟各组织中溶菌酶活性变化

对照组及各实验组常温下血清、肝、幽门毛囊、胃、肠、鳃组织中溶菌酶活性变化情况如图2所示，而热刺激后的变化见图3。

由图2可见，常温养殖条件下，各组织中溶菌酶活性差别较大，但是各实验组测定结果呈现较一致的变化趋势，均为肠及幽门毛囊组织中酶活性较高，而血清、胃和鳃组织中活性较低。在平均酶活性最高值出现在肠组织中，为 5.21 μg/g，各组别在该组织中酶活性大小为:方一组＞贯众组＞对照组＞方二组，且方一组显著高于对照组，极显著高于方二组。且除了方一组中幽门毛囊组织外，方一及贯众实验组各组织的酶活性均高于对照组，方一鳃组织中酶活性更是显著高于其他三组，而方二组各组织中酶活性都偏低。

由图3可见，高温刺激后，各组织内酶活性的总体分布趋势不变，但肠组织内酶活性普遍降低，但酶活性大小依然为:方一组＞贯众组＞对照组＞方二组，最大值为5.89 μg/g。与常温相应实验组相比，方一组肝组织中酶活性显著提高，鳃组织中极显著提高。且高温方一组血清及肝脏中酶活性均显著(P＜0.05)高于其他3个高温刺激实验组。

表2 中药方剂对施氏鲟白细胞吞噬作用的影响Tab.2 Effect of leukocytic phagocytosis in Amur sturgeon

图2 常温下溶菌酶活性变化Fig.2 Variety of lysozyme activity under usual temperature

图3 热刺激后溶菌酶活性变化Fig.3 Variety of lysozyme activity after heat stress

3 讨论

选用单方贯众，及自组复方方一和方二，通过对施氏鲟口灌给药14 d后，对鱼体内各组织中免疫相关活性物质及酶活性的测定结果表明，中药方剂对施氏鲟非特异性免疫功能有一定的影响，且在高温刺激下表现出一定的应答反应。

3.1 中药方剂对施氏鲟血液中蛋白含量的影响

鱼类血液指标被广泛用来评价鱼类的健康状况、营养状况及对环境的适应状况的生理、病理和毒理学指标［10］。有报道指出，一些活性多糖能提高鱼类饲料利用率及其机体血糖水平，相应的加速了对葡萄糖的蛋白合成，细胞分泌到血液中的蛋白量增加，代谢旺盛，致使血清中总蛋白含量也增加，增强蛋白质合成代谢，提高鱼体增重率和特定生长率，从而促进鱼体生长［11－13］。实验结果表明，选用方剂贯众及方二均有效提高了施氏鲟血浆中总蛋白含量，而方一常温组随略低于对照组，但是高温刺激组有显著提升，这样的结果与以上研究结论一致。

而血清中球蛋白含量在一定程度上对机体的免疫状态有所影响［14］，其含有的γ－球蛋白，对机体免疫具有促进作用。实验中，除常温方一组外，其余各组球蛋白含量均高于对照组，且常温贯众组显著高于常温方一组。这样的结果表明，中药方剂对施氏鲟血清中免疫相关活性物质有促进作用。

综上，贯众及方二口灌给药14 d，能有效提高施氏鲟血清中总蛋白、白蛋白及球蛋白含量，有利于提高鱼体非特异性免疫能力及促进鱼体快速生长。而方一在常温养殖下无显著作用，但是在应答高温刺激时，对鱼体血清中蛋白含量的提升有显著的促进作用。

3.2 中药方剂对施氏鲟白细胞吞噬能力的影响

动物体内的吞噬细胞可以吞噬进入体内的异物，吞噬细胞在消化病原生物的同时可保留有关抗原信息并将其传递给相关的淋巴细胞，从而激发机体的体液免疫和细胞免疫。因此，吞噬细胞的吞噬活性直接与动物的免疫机能有关。鱼类白细胞对病原菌的吞噬和杀菌作用也是鱼类非特异性免疫的一个重要方面［15］。

已有研究证实，在饲料中添加适量的免疫增强剂［16］或免疫多糖［17］能增强鱼类非特异性免疫功能，有效提高其白细胞吞噬活性。而贯众及方二给药常温组白细胞吞噬率略高于对照组，而高温刺激后则略低于对照组，但并未形成显著性差异。而方一常温组略低于对照组，但高温刺激后显著高于所有组别。这样的实验结果表明，本文所选用的单方贯众及两个复方对施氏鲟白细胞吞噬功能均无显著提升，但方一能促进机体在热刺激情况下做出有益、高效的应答反应。

3.3 中药方剂对施氏鲟各组织中溶菌酶活性的影响

溶菌酶也是鱼类抵抗并与菌感染的重要因素［18］，它的量和活性变化是由于免疫物质刺激巨噬细胞分化导致溶菌酶基因复制来进行的［19］。

本实验结果表明肠及幽门毛囊内溶菌酶活性较高，而血清和鳃组织内较低，与报道的虹鳟添加免疫调节剂在局部消化道内的免疫反应比系统免疫反应变化大［20］相一致。而在中药方剂的作用下，虽然大部分组织中溶菌酶活性略高于相应的对照组，但基本未形成显著性差异，与白细胞的小浮动变化相似，这样的结果符合已报道的溶菌酶的活性变化与循环系统中白细胞数目变化相一致［21］。且值得注意的是，方一给药的实验组在热刺激后各组织中溶菌酶活性下降较少，表现出较强的应答反应。

综上所述，实验选取的中药方剂对施氏鲟血清中蛋白含量，白细胞吞噬能力及各组织中溶菌酶活性均有一定的提高和促进作用。贯众及方二对于鱼血清中各种蛋白含量提高及白细胞吞噬活性有较好的促进和增强作用，而方一在促进鱼体对高温刺激做出高效应答、提高鱼体应急情况下的免疫调节有较好的作用。

［1］王芸，李健，刘淇，等.5种中草药对凡纳滨对虾生长及非特异性免疫功能的影响［J］.安徽农业科学，2007，35(26):8236－8239.

［2］李霞，马驰原，李雅娟，等.中草药对牙鲆免疫力的影响［J］.东北农业大学学报，2011，42(3):60－67.

［3］孟兆娜，陈玉春，刘敏.复方中草药对镜鲤(Cyprinus carpio var.Specularis)幼鱼非特异性免疫功能的影响［J］.东北农业大学学报，2011，42(3):54 －59.

［4］韩庆，马雨林.不同中草药添加剂饲喂黄颡鱼试验［J］.养殖与饲料动物疾病防治，2006，12:54－56.

［5］陈孝煊，吴志新，殷居易.大黄、穿心莲、板蓝根和金银花对异育银鲫免疫机能的影响［J］.中国水产科学，2003，10(1):36－41.

［6］刘红柏，卢彤岩，张春燕，等.黄芪对史氏鲟抗氧化能力及免疫力的影响［J］.大连水产学院学报，2006，21(3):231－235.

［7］黄江，魏巍，王荻，等.中草药方剂对施氏鲟血浆和肝脏中一氧化氮、丙二醛含量及一氧化氮合酶活性的影响［J］.水产学杂志，2009，22(3):28 －31.

［8］刘红柏，黄江，马爱枝，等.中草药复方添加剂对施氏鲟生长及血液生化指标的影响［J］.水产学杂志，2009，22(3):14－18.

［9］王树芹，周洪琪.壳聚糖对异育银鲫溶菌酶和白细胞吞噬活性的影响［J］.上海水产大学学报，2004，13(2):121－125.

［10］李懋，黄二春，魏于生，等.淡水鲳六项血液指标的测定及血细胞结构的显微观察［J］.淡水渔业，1992，3:20－23.

［11］Misra C K，Das K B，Mukherjee S C.Effect of long term administration of dietary β – glucan on immunity，growth and survival of Labeo ro－hitafiri－ geilings［J］.Aquaculture，2006，255:82 －94.

［12］Gopalakannan A，Arul V.Immunomodulatory effects of dietary intake of chitin，chitosan and levamisole on the immune system of Cyprinus carpio and control of Aeromonas hydrophilainfection in ponds［J］.Aquaculture，2006，255:179－187.

［13］刘洪丽，陈忠伟，胡庭俊，等.马尾藻多糖对奥尼罗非鱼生长性能、血液生化指标和免疫调节的影响［J］.安徽农业科学，2009，37(29):14215 －14217.

［14］刘红柏，黄江，马爱枝，等.中草药复方添加剂对施氏鲟生长及血液生化指标的影响［J］.水产学杂志，2009，22(3):14－18.

［15］板田胜信.鱼类免疫と免疫系［J］.北海道水产孵化场研报，1988，43:11－35.

［16］刘勇，贾永红.免疫增强剂对河鲫鱼白细胞吞噬和溶菌酶活性的影响［J］.安徽农业科学，2007，35(1):111－113.

［17］陈昌福，吴凡，熊传喜，等.免疫多糖(酵母细胞壁)对受免异育银鲫免疫应答的调节作用［J］.淡水渔业，2004，6(4):55－57.

［18］川原逸郎，楠田理一.养殖ゥナキのぅソチサム活性の特性［J］.日本水产学会志，1988，54(6):965－968.

［19］Paulsen S M，Engstad R E，Robertsen B.Enhanced lysozyme production in Atlantic salmon(Salmo salar L.)macrophages treated with yeast beta－glucan and bacterial lipopolysaccharide［J］.Fish ＆ Shellfish Immunol，2001，11(1):23 －37.

［20］Clerton P，Troutaud D，Verlhac V.Dietary vitamin E and rainbow trout(Oncorhynchus mykiss)phagocyte functions:effect on gut and on head kidney leucocytes［J］.Fish ＆ Shellfish Immunol，2001，11(1):1 －13.

［21］Masahiro S.Current research status of fish immunostimulants［J］.Aquaculture，1999，172:63－92.