张敏莹，徐东坡，段金荣，刘 凯，周彦锋，施炜纲

(中国水产科学研究院 淡水渔业研究中心，中国水产科学研究院 内陆渔业生态环境和资源重点开放实验室，农业部 长江下游渔业资源环境科学观测实验站，江苏 无锡 214081)

日本沼虾(Macrobrachium nipponense)又称青虾或河虾，隶属于甲壳纲，十足目，长臂虾科，沼虾属。日本沼虾是中国重要的淡水经济养殖虾类，它广泛分布于中国淡水水域，尤以五大淡水湖泊(鄱阳湖、洞庭湖、太湖、洪泽湖和巢湖)资源分布量大。洮湖(又名长荡湖)位于江苏省南部、太湖流域上游，地处金坛、溧阳两市交界处，是江苏省十大淡水湖泊之一。洮湖日本沼虾以个体大、生长快、品质好等优点而闻名，是国家级水产种质资源保护区的重点保护种类。对一个特定物种或种群遗传多样性的了解是保护和利用这一物种或种群的基础。关于日本沼虾遗传多样性的研究已有不少报道［1－9］，但还未见关于洮湖日本沼虾遗传多样性的报道。自2007年5月太湖蓝藻暴发后，太湖流域水域污染及其治理引起广泛关注和高度重视。目前随着“引江济太”工程的逐步推进，作为6大引排水工程之一的新孟河延伸拓浚工程被列为近期规划实施工程。按照规划，拓浚工程后洮湖将每年引进太湖水，实现年换水2.5次。引水是否会对洮湖渔业资源产生影响?引水前后洮湖日本沼虾的遗传多样性是否会发生变化?这些问题目前还未见报道。

本文采集洮湖日本沼虾样品，运用RAPD技术和微卫星(SSR)技术对其遗传多样性进行研究。初步了解洮湖日本沼虾的遗传多样性现状，为客观评价新孟河延伸拓浚工程对洮湖国家水产种质资源保护区的影响及洮湖日本沼虾种质资源的保护提供本底资料和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

日本沼虾样本于2011年11月16日采自洮湖种质资源保护区。样品(大于1000只)采集后，直接用95%的酒精浸泡，带回实验室保存于4℃冰箱备用。

1.2 基因组DNA制备

随机选取日本沼虾样本进行总DNA提取。剪取附肢肌肉组织约100 mg，剪碎，研磨至粉末状，放入1.5mL 的离心管中，加入450μL 的 TE 缓冲液(10mmol/LTris－HCI，pH8.0，100mmol/L EDTA，pH8.0)，再加入终浓度分别为0.5%的SDS和200 ng/μL的蛋白酶K。上述混合物于56℃消化4 h至溶液澄清透明，经酚、氯仿抽提，冰乙醇沉淀。提取的DNA经70%的乙醇洗涤，室温干燥后溶于适量ddH20中，置于－20℃保存备用。DNA浓度通过紫外分光光度计和电泳－EB染色的荧光强度双重测定。

1.3 微卫星引物及随机引物

微卫星引物合成参照冯建彬等［9］设计合成5对微卫星引物，由上海生物工程技术服务有限公司合成，引物信息见表1。实验共用2个系列40个随机引物，分别为上海申能博采生物科技有限公司的A、B系列，最后筛选出17个扩增条带清晰、重复性好的引物(表2)。

表1 本实验所用的日本沼虾微卫星位点及其引物Tab.1 SSR loci and primers used in the paper of Macrobrachium nipponense

1.4 PCR反应及电泳条件

RAPD 扩增总体积为 25μL，反应混合物中包括 PCR Buffer2.5μL，MgCl22.0μL(25mmol/L)，基因组 DNA 1μL(20 μg/mL)，Taq DNA 聚合酶 0.2μL(5 U/μL);dNTPs 2μL(各 2.5mmol/L);引物1μL(20μmol/L);用ddH20补足25μL体积。94℃预变性3min后进行35个循环，每个循环包括94℃ 45 s、36℃ 45 s、72℃1min，最后于72℃延伸8min。反应结束后4℃保存。反应结束后取扩增产物8μL在1.2%的琼脂糖凝胶上进行电泳分离(1×TAE，5 V/cm，约1 h)，EB染色，UV－II紫外透射分析仪上观察和拍照。

微卫星 PCR 反应体系为 10μL，包括 10×buffer(含 Mg2+)1μL、2.5mmol/L dNTP 0.5μL、10μmol/L 上下游引物各 0.35μL、5 U TaqDNA 聚合酶0.1μL、50 ng/μL 的 DNA 模板 1μL，用超纯水补足10μL。PCR反应在ABI 2720 PCR仪中进行，反应程序为:94℃预变性4min;94℃变性30 s，52～61℃(根据引物的不同选择温度)复性45 s，72℃延伸45 s，30个循环;72℃终延伸8min，4℃保存。PCR产物采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，参照许绍斌等［10］快速银染检测，拍照保存。

1.5 RAPD数据处理

根据RAPD扩增结果，扩增条带有且清晰记为1，否则记为0，构建原始数据表征矩阵;根据微卫星扩增结果，依据等位基因片段长度从小到大标为A、B、C等，并据此构建扩增结果数据矩阵，采用软件PopGen32对RAPD研究中多态位点比例、Shannon多样性指数及SSR扩增中每个位点的等位基因数(A)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)等遗传学参数进行计算。其中，P=多态位点数/位点总数×100%;Shannon多样性指数(Chalmers K J et al，1992):I= －ΣPilnPi(Pi为位点i在某一群体中的出现频率)，多态信息含量(PIC)参照Bostein等［11］的方法计算。

2 结果分析

2.1 RAPD 扩增结果

从40个10 bp随机引物中筛选出17个扩增效果好的引物。17个随机引物的扩增结果表明，15个引物为多态性引物，2个引物为单态引物。图1为随机引物B15对洮湖日本沼虾的扩增电泳图。每个引物扩增出3～8条清晰且重复性强的条带，其片段大小在100～1000 bp之间，共计95条，其中46条带表现为多态，多态位点比例为16.67% ～66.67%，平均为48.42%;遗传杂合度H为0.1960，Shannon多样性指数I为0.2576。17个引物的扩增情况见表2。

图1 引物B15对洮湖日本沼虾的RAPD扩增电泳图(Marker为 100 bp+1.5 kb DNA ladder)Fig.1 RAPD bands by primer B15 of Macrobrachium nipponense in Taohu Lake(Marker:100 bp+1.5 kb DNA ladder)

表2 洮湖日本沼虾17个随机引物序列及RAPD扩增结果Tab.2 Sequences and amplification results of 17 random primers of Macrobrachium nipponense in Taohu Lake

2.2 SSR扩增结果

将合成的5对微卫星引物对洮湖日本沼虾群体(共30尾)进行扩增，5对引物均得到较好扩增，图2为微卫星基因座Mni03在洮湖日本沼虾群体的扩增结果。各位点等位基因数、有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度和多态信息含量如表3。在5个微卫星基因座中，共检测到50个等位基因，每个位点平均等位基因数为10，平均有效等位基因数为5.5474。

图2 微卫星基因座Mni03在洮湖日本沼虾群体的扩增结果(M为pBR322 DNA/Msp1分子量标准)Fig.2 PCR result of Mni03 locus in Taohu Lake population of Macrobrachium nipponense

5个微卫星位点观测杂合度为0.6621～0.8533，期望杂合度为0.6842～0.8674，多态信息含量为0.3893 ～0.7123，平均观测杂合度为0.7425，平均期望杂合度为 0.7766，平均多态信息含量为 0.5740。在这5个位点中有3个位点表现为高度多态(PIC＞0.5)，2个位点表现为中度多态(0.25＜PIC＜0.5)。

表3 洮湖日本沼虾群体微卫星分析结果Tab.3 Result of SSR study of Macrobrachium nipponense in Taohu Lake

3 讨论

(1)郭闯等［12］采用ISSR技术对江苏长江和太湖2个地区日本沼虾群体的遗传多样性进行了分析，结果显示日本沼虾长江和太湖两群体的多态位点比率均为63.64%，Shannon多样性指数分别为0.3480和0.3465;吴滟等［5］对太湖不同水域(无锡、宜兴、苏州及湖州水域)野生日本沼虾进行了RAPD分析，结果表明四个群体的多态位点比例分别为 49.57%、60.68%、53.85%、57.26%，杂合度为 0.2077 ～0.2163，Shannon多样性指数0.2967～0.3053;本研究RAPD扩增结果表明洮湖日本沼虾多态位点比例为48.42%，杂合度为 0.1960，Shannon多样性指数 0.2576，多态位点比例(48.42%)和 Shannon 多样性指数(0.2576)略低于日本沼虾长江群体(63.64%，0.3480)，与吴滟等对太湖日本沼虾(无锡和苏州水域)的研究结果类似，与其它地区野生虾类［6－7］比较，洮湖日本沼虾遗传杂合度处于较高水平，群体遗传多样性水平较丰富，种质资源保存较好。

冯建彬等［8］用12个微卫星引物扩增吴江、滨湖、宜兴和吴兴4个太湖日本沼虾群体，结果表明4个群体平均观测杂合度(Ho)为 0.7500 ～0.8222，平均期望杂合度(He)为 0.8886 ～0.9149，说明太湖日本沼虾群体具有较高遗传多样性，其中宜兴和滨湖群体遗传多样性高于吴江群体。本研究SSR扩增结果表明，洮湖日本沼虾群体的平均观测杂合度(Ho)为0.7425，平均期望杂合度(He)为0.7766，平均期望杂合度(He=0.7766)高于泰国罗氏沼虾(He=0.64 ～0.73)［13］，与洪泽湖日本沼虾9个野生群体［9］的遗传多样性相近(He为0.6982 ～0.8044)，略低于上述太湖日本沼虾SSR研究结果，推测是由于本研究所选微卫星位点较少所致。

一般认为每种分子标记都有其局限性，因方法不同其结果有可能存在差异。本文采用2种方法对洮湖日本沼虾群体遗传多样性进行了研究，结果都表明洮湖日本沼虾群体遗传多样性较丰富，因此在湖区建立日本沼虾种质资源自然保护区，可以更好地有效保护日本沼虾野生种质资源。

(2)洮湖作为江苏十大淡水湖之一，具有丰富野生日本沼虾资源。本文对洮湖日本沼虾野生群体的遗传多样性进行了分析，初步掌握了洮湖日本沼虾的遗传多样性现状。虽然样本是从大量样本(大于1000只)随机抽取，但由于实验样本数不是很大，且采样点集中于洮湖种质资源保护区，因此所得结果可能与整个湖泊日本沼虾遗传多样性的实际水平有所出入。洮湖不同湖区日本沼虾的遗传多样性有待于进一步研究。

尽管本研究表明，洮湖日本沼虾野生群体目前尚保持了较高的遗传多样性，但拓浚工程后洮湖将每年引进太湖水，实现年换水2.5次。引水导致的水质、水草生长情况变化及外来种群的入侵可能导致遗传多样性的降低及种质混杂。因此，应采用多种分子标记技术，对洮湖日本沼虾的遗传多样性进行系统的跟踪监测，全面了解其遗传多样性水平及变化规律，进而指导洮湖日本沼虾种质资源的保护和利用。

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