刘莲莲，张应龙，杨海莹，马卫明 ，曹永芝

(1.山东商业职业技术学院，山东 济南 250103;2.国家农产品现代物流工程技术研究中心，山东 济南 250103;3.山东农业大学 动物科学与技术学院，山东 泰安 271018)

当前对大肠杆菌病的治疗主要以抗生素为主，然而近年来由于抗生素滥用，耐药菌株不断出现，常用治疗药物的疗效越来越差，通过研究不同治疗条件下大肠杆菌对仔兔肠道显微结构的影响，比较常用抗生素庆大霉素和生物活性物质乳酸菌素的治疗效果，对兽医临床提供理论支撑，对研究大肠杆菌的致病机理有重要作用。兔大肠杆菌病又称粘液性肠炎，是由致病性大肠杆菌及其产生的毒素引起的一种暴发性肠道性疾病［1］，以断奶后不久的幼兔多发，且病程长、反复发作、死亡率高。佟承刚等［2］对腹泻病死兔检验结果表明，以大肠杆菌为病因的占首位，大肠杆菌一般分为肠毒性大肠杆菌(ETEC)、非肠毒性大肠杆菌(EPEC)和侵袭性大肠杆菌(EIEC)。国内外研究表明，只有非肠毒性大肠杆菌所致的家兔肠炎是最重要的［3－10］。绒毛和微绒毛是小肠最具特征性的结构，是动物营养吸收的重要场所。小肠的绒毛长度、黏膜厚度、绒毛表面积都是衡量小肠消化吸收功能的重要指标［11］。绒毛长度、黏膜厚度增加可使小肠吸收面积扩大，有利于营养物质的吸收［12，13］。绒毛和隐窝深度的比值常常可以说明肠上皮细胞更新代谢的程度。兔小肠绒毛长度随着日龄的增加而增大，腺窝深度增加，大肠杆菌等应急可使肠绒毛变短［14］。Peeters等［15］对比利时和荷兰养兔场调查表明，21个兔场中的70%存在能粘附肠上皮并破坏微绒毛的大肠杆菌。肠黏膜屏障是由肠黏膜上皮细胞、肠黏液层、肠黏膜免疫系统、肠道正常微生物群等环节组成的复杂的防御系统，在阻止病原微生物入侵方面有非常重要的作用。肠黏膜上皮细胞层则是机体与内外环境之间的第一道屏障［16］。它是将宿主的结缔组织和外界环境隔离开的物理屏障。阻挡细胞旁路运输的细胞紧密连接和富含肌动蛋白的微绒毛相结合在上皮细胞的顶部可以抵挡外界微生物附着和入侵。作为一个选择性通透屏障，上皮细胞允许营养物质、电解质和水的通过，而对肠内的毒素和抗原则保持着一种有效的抵抗。各种原因引起腹泻的共同特点是造成肠道粘膜上皮的损伤，肠道粘膜上皮的损伤和修复是腹泻发生的中心环节［17］。鲍国连［18］等对该病引起兔体的理化参数变化及病理特性进行了深入研究，但对该病引起肠道显微结构的研究国内相对较少，本研究利用致病性大肠杆菌通过腹腔注射感染家兔，观察不同治疗条件下兔腹泻过程中临床症状、大体剖检变化、病理组织学变化以及超微结构的变化。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 30～40日龄健康新西兰兔，购自山东鲁抗医药股份有限公司(合格证号:0008991，许可证号:scxl鲁20080002)。

1.1.2 大肠杆菌 (CICC编号:23657)，由济南出入境检验检疫局提供。

1.1.3 大肠杆菌悬液的制备 将大肠杆菌接种于高压灭菌的肉汤中，恒温培养箱培养28 h，活菌数达到2×109个/mL。

1.2 实验方法

1.2.1 动物处理及分组 40只30～40日龄新西兰兔，体质量为750～1000 g，室温22～24℃饲养，自由进食水，光照周期为12 h/12 h，饲养环境安静，通风良好。预饲1周后随机分为4组，每组10只，第1组为正常对照组(G1)，于试验当天腹腔注射生理盐水2mL;第2组为大肠杆菌感染组(G2)，腹腔注射大肠杆菌培养液2mL;第3组为庆大霉素治疗组(G3)，腹腔注射大肠杆菌培养液2mL，出现症状后(注射菌液后第2天)肌注庆大霉素0.5mL(2万U/mL)∕只，连续注射3 d;第4组为乳酸菌素治疗组(G4)，腹腔注射大肠杆菌培养液2mL，出现症状后(注射菌液后第2天)口服乳酸菌素1片(400 mg/片)，连续3 d。每日观察家兔的临床症状，人工感染后1、3、5 d各组随机选取3只家兔剖检，记录剖检变化。

1.2.2 肠道的光镜观察 取上述1.2.1剖检家兔的肠管组织用4%的多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片、HE染色后，光镜观察其组织病理学变化。

1.2.3 肠道超微结构的电镜观察 取试验1.2.1剖检家兔空肠0.5 cm，生理盐水漂洗干净后立即放入2.5%的戊二醛中固定，PBS洗涤，1%锇酸后固定，梯度乙醇及纯乙酸乙酯脱水，临界点干燥，喷金镀膜后置扫描电镜下观察。

2 结果与分析

2.1 家兔临床症状的变化

图1 感染后第3天肠粘膜显微结构的变化Fig.1 The changes of intestine microstructure on the third day after infection

大肠杆菌感染组(G2)兔注入大肠杆菌后第1天精神沉郁，出现腹泻症状;第2天食欲减退或废绝，粪便粒细小、两头尖、成串、外有透明样黏液;第3天有2只死亡，水泻、粪便呈黄色或棕色，肛门附近及后脚被稀粪污染;第4天精神有所好转，饮食量逐渐增加;第5天腹泻症状减轻，家兔活动量和饮食量有所增加，第7天家兔精神良好，腹泻症状消失，饮食量和活动量基本正常。庆大霉素治疗组(G3)于第2天和出现明显临床症状，第5天基本恢复正常，未见死亡。乳酸菌素治疗组(G4)第2天开始出现明显症状，第7天基本恢复正常。对照组未出现腹泻症状和其他临床症状。

2.2 腹泻家兔的剖检变化

大肠杆菌感染组(G2)兔第1天肝脏、肾脏、脾脏稍有肿大，胃底部粘膜充血，十二指肠、空肠、结肠和盲肠粘膜均有不同程度的充血、出血、水肿、肠壁变薄、膀胱充盈;第3天胃膨胀，回肠内容物呈胶样，结肠有透明淡黄色胶样黏液，肝脏呈暗褐色，有出血点，严重者肠壁呈半透明状，肠管内充满黄色或褐色的稀薄内容物;第5天剖检变化减轻。有个别兔出现纤维素性肝周炎。与大肠杆菌感染组相比，庆大霉素治疗组(G3)和乳酸菌素治疗组(G4)剖检变化明显减轻，第5天基本正常，对照组剖检未见异常。

2.3 家兔病理组织学的变化

大肠杆菌感染组(G2)第1天空肠绒毛出现萎缩、脱落，杯状细胞数量增多;第3天空肠绒毛出现明显萎缩、断裂、脱落，损伤较为严重(图1);第5天肠道损伤减轻。与G2组相比，G3和G4组第3天空肠绒毛损伤减轻(图1);第5天肠道萎缩程度明显减轻，空肠绒毛的形态和排列趋于正常。对照组肠道组织结构正常、绒毛排列整齐、肠腺轮廓清晰。

2.4 家兔肠道超微结构的变化

图2 感染后第3天肠道粘膜超微变化Fig.2 The changes of intestine ultrastructure on the third day after infection

大肠杆菌感染组(G2)感染第3天空肠绒毛顶端出现萎缩、脱落(图2)，微绒毛脱落，排列杂乱稀疏、紊乱(图3)，部分上皮细胞脱落(图4)。

与G2组相比，G3和G4组第3天空肠绒毛顶端和微绒毛的脱落现象减轻，损伤轻微。对照组空肠绒毛排列整齐，微绒毛分布均匀致密，排列整齐。

3 结论与讨论

徐倩倩等［19］研究了白头翁素对PRV(轮状病毒)、E.coli(大肠杆菌)混合感染性小鼠腹泻肠道超微结构的影响，表明白头翁素对轮状病毒和大肠杆菌混合感染性腹泻具有显著防治功效的机制与其抵抗肠道粘膜损伤并加速粘膜修复有关，本研究表明兔引发大肠杆菌病时，生物活性物质乳酸菌素的治疗机制也与微结构修复有关，与小鼠作用机理相同。2种药物对兔大肠杆菌均有有效的治疗作用，并且在疾病恢复期乳酸菌素的治疗效果优于庆大霉素，所以当仔兔发生大肠杆菌病时，可以尝试使用生物活性物质，以有利于小肠绒毛、微绒毛和上皮细胞的恢复。通过超微结构的观察，课题组下一步将讨论不同的治疗条件对肠道小肠黏膜免疫的影响，该研究对后续研究有重要意义。

图3 感染第3天微绒毛超微变化Fig.3 The changes of Microvilli ultrastructure on the third day after infection

图4 感染后肠道上皮细胞的超微变化Fig.4 The changes of Intestinal epithelial cells ultrastructure after infection

小肠的正常结构与功能是营养物质被充分消化与吸收的基本保证，特别是小肠的肠粘膜厚度、绒毛长度、隐窝深度及绒毛表面积是衡量小肠消化吸收功能的重要指标［20，21］，肠绒毛长度与细胞数量呈显著相关，绒毛短时，成熟的绒毛细胞减少，对养分的吸收能力降低。兔小肠绒毛在病理状态下的变化表明，大肠杆菌引起的腹泻对小肠正常组织的形态学结构产生损害，引起酶水平和吸收能力的下降。随着肠绒毛长度和粘膜厚度的恢复，病兔逐渐恢复正常［22］。从不同实验组之间的临床症状、大体剖检变化、病理组织学变化以及超微结构变化的差异说明庆大霉素和乳酸菌素对于大肠杆菌引起的腹泻治疗作用明显，在疾病恢复期乳酸菌素的治疗效果好于庆大霉素，所以生物活性物质乳酸菌素对大肠杆菌引起的腹泻有较好的治疗作用，微生态制剂等其他生物活性物质对大肠杆菌引起的腹泻是否优于乳酸菌素有待于进一步研究。

紧密连接是肠黏膜屏障的重要组成部分，它可以控制大分子水溶性物质在肠上皮细胞中的自由进出。庾庆华等［23］通过大肠杆菌K88感染体外培养的Caco－2细胞单层模型和大鼠灌胃实验，发现宿主细胞间的连接变得松散，Occludin、Claudin－1、Zo－1、E－cadherin的分布变得紊乱、表达量下降，使紧密、粘附连接遭到破坏。Zhang等［24］发现随着病原性大肠杆菌的感染，紧密连接结构受到损伤，紧密连接形态的改变伴随着细胞旁通路的渗透性增加，导致紧密连接屏障功能的损坏。本实验通过对感染大肠杆菌后不同时期肠道超微结构变化发现与上述结果一致。通过扫描电镜观察发现，感染大肠杆菌后，部分上皮细胞脱落，且上皮细胞表面的微绒毛也发生大面积脱落现象，肠道损伤较为严重。杯状细胞分泌的粘液糖蛋白可与病原微生物竞争抑制肠上皮细胞上的粘附素受体，抑制病菌在肠道的粘附定植［25］，但由于上皮细胞损伤较严重，这一抑制病菌在肠道粘附定值的作用大大减弱。微绒毛是细胞表面的细长指状突起，广泛存在于动物细胞表面，是小肠柱状上皮细胞的细胞膜向肠腔方向形成的突起，呈细长的圆筒状，小肠上的微绒毛使细胞的表面积扩大了30倍，大大有利于大量的吸收营养物质，不论微绒毛的长度还是数量，都与细胞的代谢强度有着相应的关系。大肠杆菌其致病性主要依靠其紧密地粘附于肠上皮细胞，导致微绒毛的损伤和柱状上皮细胞损害，造成细胞膜通透性增强，引起肠道炎症和腹泻、血液中白细胞增多，有大量炎性细胞侵害实质脏器和消化道。毒素和有害物质被吸收后，改变了肠道通透性，导致电解质从血液中渗入消化道［26］。微绒毛的脱落使细胞与外环境的物质交换能力减弱，不利于营养物质的吸收，细胞代谢强度减弱，大肠杆菌引起的腹泻与绒毛、微绒毛和上皮细胞等结构损伤与修复有关，而乳酸菌素有利于增强其修复功能。乳酸菌素对大肠杆菌引起的局部黏膜免疫是否有增强作用，有待于进一步研究。

［1］王照福，章晓卫，姚光光，等.养兔和兔病防治［M］.北京:北京出版社，1999:245－247.

［2］佟承刚.家兔大肠杆菌性腹泻的病原特性研究［J］.中国畜禽传染病，1990(2):3－4.

［3］房海.人及动物病原细菌学［M］.石家庄:河北科学技术出版社，2002:454－486.

［4］秦爱建.非肠毒性大肠杆菌致家兔的肠道感染［J］.中国养兔杂志，1989(4):28－29.

［5］Johea E，Peeters，Jierre P，et al.Pathogenic properties of Escherichia coli strains isolated from diarrheic commercial rabbits［J］.Chin Microbiol，1984，20(1):34 －39.

［6］Marenda M，Milon A，Bauerfeind，et al.Eneropathogenic(EPEC－like)Escherichia coli negative for Shiga like toxins from weaned rabbits［J］.Revue－de－Medecine－Veterinaire，1992，143(4):333 －340.

［7］Blanco J E，Blanco M，Blanco J，et al.Serotypes，toxins and antibiotic resistance of Escherichia coli strains isolated from diarrhoeic and healthy rabbits in Spain［J］.Vet Microbiol，1994，38(3):193 －201.

［8］Bole－Hribovsek－V，Mehle J，Mrzel I，et al.Enteropathogenic Escherichia coli in rabbits in Slovenia［J］.Abornik－Veterinaske－Fakultete－Univerza－Ljubljana，1992，29(2):235－245.

［9］Licois D.Enteropathogenic Escherichia coli from rabbits［J］.Annalesde Recherches Veterinaire，1992，23:27 －48.

［10］Penteado A S，Ugrinovich L A，Blanco J，et al.Serobiotypes and virulence genes of Escherichia coli strains isolated from diarrheic and healthy rabbits in Brazil［J］.Vet Microbiol，2002，89(1):41－51.

［11］沈霞芬.家畜组织学与胚胎学［M］.北京:中国农业出版社，2001.

［12］韩正康.家畜营养生理学［M］.北京:农业出版社，1991:16－17.

［13］成令忠.组织学［M］.北京:人民卫生出版社，1994:1102－11.

［14］杨全名.仔猪消化道酶和组织器官生长发育规律的研究［D］.北京:中国农业大学，1999.

［15］Peeters J E.Pathogenic properties of Escherichia colistrains isolated from diarrheic commercial rabbits［J］.Chin.Microbiol.，1984，20(1):34 －39

［16］李正平，杨倩.肠道病原性大肠杆菌和宿主细胞间的相互作用［J］.江西农业大学学报，2010，32(1):141－143.

［17］顾宪红，张宏福，佘锐萍，等.断奶日龄对仔猪肠黏膜形态的影响［J］.畜牧兽医学报，2001，32(4):306－313.

［18］鲍国连，佟承刚，韦强，等.家兔大肠杆菌所致腹泻兔机体理化参数变化及病理特性研究［J］.中国养兔杂，2001(1):20－22.

［19］徐倩倩，马利芹，张晓利，等.白头翁素对PRV、E.coli混合感染性腹泻肠道超微结构的影响［J］.中国农学通报，2010，26(19):13 －17.

［20］李可洲，李宁，黎介寿，等.短链脂肪酸对大鼠移植小肠形态及功能的作用研究［J］.世界华人杂志，2002，10(6):720－722.

［21］Varel V H，Robinson I M，Pond W G.Effect of dietary copper sulfatd，aureaosp 25，or clinoptilolite on ureolytic bacteria found in the pig large intestine［J］.Appl Environ Microbiol，1987(53):2009－2012.

［22］刘莲莲，马卫明，曹永芝，等.大肠杆菌对仔兔小肠形态学影响及其治疗方法的比较［J］.江西农业大学学报，2012，34(1):124－128.

［23］Yu Q H.Diversity of tight junctions(TJs)between gastrointestinal epithelial cells and their function in maintaining the mucosal barrier［J］.Cell Biology International，2009.

［24］Zhang Q，Li Q R.Enteropathogenic Escherichia coli changes distribution of occludin and Zo－1 in tight junction membrane microdomains in vivo［J］.Microbial Pathogenesis，2009:1 －7.

［25］Specian R D，Oliver M G.Functional biology of intestinal goblet cells［J］.Am J Physiol，1991，26(l):183－193.

［26］董亚芳.家兔腹泻病的探讨［J］.中国养兔杂志，1985(1):29－32.