王苑桃 雷成康 王 颖 谢志民 西安市食品药品检验所（西安710054）

活血止痛散（片）是2012年国家评价性抽验项目，由当归、三七、制乳香、冰片、土鳖虫、煅自然铜6味中药组成，具有活血散瘀，消肿止痛的功效，主要用于跌打损伤，瘀血肿痛等症。当归为方中君药，现行标准以阿魏酸为标的物，采用HPLC 方法进行测定，但散剂现行标准供试品溶液制备方法太过复杂，阿魏酸损失严重，测出率和限度偏低；片剂5个现行注册标准方法各异，限度差异较大。制乳香为方中臣药，具有活血止痛、消肿生肌的作用，现行质量标准均无含量控制要求。本次研究参照中国药典［1］等资料，本文建立了用可变检测波长HPLC法测定成品中阿魏酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的含量测定方法，作为成品中当归和制乳香的质量控制方法。

1 仪器与试药 1.1 仪器 安捷伦1260型高效液相色谱仪，Agilent ChemStation for LC Systems色谱工作站；Kromasil C18（250mmX4.60mm 5μm）色谱柱；北京普析通用分析仪器有限责任公司TΜ－1800PC 型紫外可见分光光度计；昆山市超声仪器有限公司KQ－700DE型数控超声波清洗器。

1.2 试剂与试药 乙腈为色谱纯（美国天地公司），其它试剂均为分析纯。阿魏酸对照品（110773－200611），11－羰基－β－乙酰乳香酸对照品（111760－200601），均为中国食品药品生物制品检定院提供（供含量测定用）。

2 方法与结果 2.1 色谱条件 采用十八烷基硅烷键合硅胶（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱，以乙腈－0.1%冰乙酸为流动相梯度洗脱（0→12min，18∶82；12→14min，18→90∶82→10；14→30min，90∶10；30→32min，90→18∶10→82；32→35min，18∶82），柱温30℃，流速1.0mL／min，检测波长0→15min为316nm，15→35min为250nm，进样量10μl。理论塔板数按阿魏酸峰计算应不低于11000，以11－羰基－β－乙酰乳香酸峰计算应不低于75000。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取阿魏酸对照品和11－羰基－β－乙酰乳香酸对照品适量，加甲醇制成每1mL 含阿魏酸4μg、11－羰基－β－乙酰乳香酸30μg的混合溶液，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取本品散剂装量差异项下的粉末，研匀，精密称取粉末0.5g；或取片剂重量差异项下的本品，研细（过三号筛），精密称取粉末适量（相当于含当归0.22g），置具塞锥形瓶中，精密加入2%甲酸甲醇溶液25mL，超声处理（功率280W，频率45kHz）30min，放凉，再称定重量，用2%甲酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 标准曲线与线性范围 精密称取阿魏酸对照品（批号110773－200611）10.60mg，置50mL 量瓶中，加甲醇使溶解，并加至刻度，摇匀，作为阿魏酸对照品储备溶液；再精密称取11－羰基－β－乙酰乳香酸对照品（批号111760－200601）9.93mg，置50mL量瓶中，加甲醇使溶解，并加至刻度，摇匀，作为11－羰基－β－乙酰乳香酸对照品储备溶液。精密吸取阿魏酸对照品储备溶液5mL、11－羰基－β－乙酰乳香酸对照品储备溶液20mL，置同一50mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为7号对照品溶液；精密吸取7 号对照品溶液10mL、5mL、3mL、2mL 和1mL，分别置25mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，分别作为6～2号对照品溶液；精密吸取7号对照品溶液1mL，置50mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为1号对照品溶液。精密吸取1～7号对照品溶液各10μl进样2次，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积平均值为纵坐标，以进样量（ng）为横坐标，计算得阿魏酸回归方程Y＝5.3638X－8.0448、r＝0.9997、11－羰基－β－乙酰乳香酸回归方程Y＝1.3253X－0.7738、r＝0.9999，表明在该系统条件下，阿魏酸进样量在4.24ng～212ng范围内、11－羰基－β－乙酰乳香酸进样量在15.888ng～794.4ng范围内，峰面积积分值与进样量呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 精密吸取上述5号对照品溶液10μl，各进样6次，按上述条件测定峰面积，计算变异系数。结果阿魏酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的RSD 分别为1.03%、1.38%，均小于1.5%，表明本实验精密度良好。

2.6 重复性试验 精密称取赤峰天奇制药有限公司活血止痛散（批号为20100402）样品粉末0.5g、江西山香药业有限公司活血止痛片（批号为120502）样品粉末0.6g各6份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入2%甲酸甲醇溶液各25mL，称定重量，超声处理（功率280W，频率45kHz）30min，取出，放凉，再称定重量，用2%甲酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液。精密吸取续滤液及标准曲线项下5号对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按标准曲线考察项下的条件测定色谱峰面积，计算。结果散剂中阿魏酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸RSD 分别为1.12%、0.82%，片剂中为1.10%、0.88%。表明散剂、片剂使用该方法测定阿魏酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的重复性均良好。

2.7 稳定性试验 分别在0、2、4、8、12、16、20、24h精密吸取同一份供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定阿魏酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸峰面积，以峰面积计算，阿魏酸散（片）剂中RSD 为1.80%（1.41%）；11－羰基－β－乙酰乳香酸散（片）剂中RSD 为0.78%（0.62%）。结果表明样品溶液中阿魏酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸在24h内稳定，可满足测定需要。

2.8 加样回收率试验 取已知含量的供试品6份，加入一定量的阿魏酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的混合对照品溶液，按供试品溶液的制备方法进行处理，按上述色谱方法进行测定，计算回收率。结果显示，散剂、片剂阿魏酸的平均加样回收率分别为97.32%和97.20%，RSD 分别为2.73%和2.21%；11－羰基－β－乙酰乳香酸的平均加样回收率分别为98.03%和99.02%，RSD 分别为2.44%和2.57%。

2.9 样品含量测定 按供试品溶液的制备方法进行处理，按上述色谱方法进行测定，记录峰面积，按外标法以峰面积计算阿魏酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的含量，33批次活血止痛散中阿魏酸含量为141.7～467.7μg／g，11－羰基－β－乙酰乳香酸的含量为0.3031～3.1665mg／g；54批次活血止痛片中阿魏酸含量为41.5～341.8μg／片，11－羰基－β－乙酰乳香酸的含量为0～1103.1μg／片。

3 讨 论 3.1 供试品制备方法的选择 本品成分相对复杂，阿魏酸又不稳定，中国药典活血止痛散项下供试品溶液制备方法太过复杂，阿魏酸损失严重，测出率和限度明显偏低；片剂YBZ30222005－2009Z、YBZ25062005－2010Z 标准采用70%甲醇加热回流的方法，YBZ01112005－2009Z标准采用50%甲醇超声处理的方法，YBZ02812006标准采用1%乙酸甲醇溶液超声处理的方法，稀释后甲醇提取，杂质较多，回流提取破坏较大，对11－羰基－β－乙酰乳香酸的提取效果亦不佳。乳香、制乳香中11－羰基－β－乙酰乳香酸的含量测定资料［2－4］采用甲醇或丙酮超声提取方法。考虑到11－羰基－β－乙酰乳香酸与阿魏酸一并提取、测定，为了提高测定方法回收率，尽量避免过多处理，减少样品用量和色谱柱污染，预试验对甲醇、酸性甲醇超声提取效果进行了考察，并与回流方法对照，结果显示以酸性甲醇超声提取效果较好。遂采用正交实验对不同甲酸浓度、超声时间和超声功率的提取效果进行考察，结果表明甲酸浓度、超声功率和超声时间对阿魏酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸的测定结果均无显著性影响。

3.2 检测波长的确定 取上述阿魏酸和11－羰基－β－乙酰乳香酸对照品储备溶液各1mL，分别加甲醇250mL，混匀，照可见－紫外分光光度法，在190～400nm 波长范围内作光谱扫描，结果阿魏酸对照品溶液在217nm、232nm 和316nm 处均有最大吸收，11－羰基－β－乙酰乳香酸对照品溶液在250nm 处有最大吸收，为了排除其它成分干扰，采用可变波长检测方法，参照中国药典选定阿魏酸检测波长为316nm、11－羰基－β－乙酰乳香酸检测波长为250nm。

［1］ 国家药典委员会.中国药典［S］.北京：化学工业出版社，2010：956.

［2］ 张振凌，郑玉丽.HPLC比较乳香炮制前后11－羰基－β－乙酰乳香酸含量［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16（14）：51－53.

［3］ 王 淳，夏 磊，宋志前，等.乳香中五种乳香酸成分分析［J］.中国中药杂志，2011，36（10）：1330－1333.

［4］ 刘元艳，王 超，夏 磊，等.活络效灵颗粒中乳香酸类成分含量分析［J］.中药研究，2011，13（5）：860－863.