李晓捷，徐磊，康贝贝

凝血因子ⅦR353Q基因多态性与中国汉族儿童脑性瘫痪的相关性研究①

李晓捷1,2，徐磊1,2，康贝贝1

目的探讨凝血因子ⅦR353Q基因多态性与中国汉族儿童脑瘫的关系。方法应用聚合酶链反应与限制性片断长度多态性分析方法对160例脑瘫患儿和137名正常儿童的凝血因子ⅦR353Q基因型和等位基因进行测定。结果脑瘫组和对照组人群凝血因子ⅦR353Q基因型分布符合Hardy-weinberg平衡定律(P＞0.05)，两组凝血因子ⅦR353Q基因型(P=0.436)和等位基因分布无显著性差异(P=0.182)。结论凝血因子ⅦR353Q基因多态性不是中国汉族儿童脑瘫发病的遗传易感因子。

脑性瘫痪；汉族；凝血因子ⅦR353Q；基因多态性

[本文著录格式]李晓捷，徐磊，康贝贝.凝血因子ⅦR353Q基因多态性与中国汉族儿童脑性瘫痪的相关性研究[J].中国康复理论与实践,2013,19(9):878-880.

脑瘫是自受孕开始至婴儿期的非进行性脑损伤和发育缺陷所导致的综合征，主要表现为运动发育障碍及姿势异常[1]。脑瘫的发病率在世界范围内约为1.5‰～4‰，平均约2‰[2]；我国约为1.8‰～4‰[3]。

凝血因子ⅦR353Q基因位于13号染色体长臂上，其基因多态性会对凝血因子Ⅶ活性产生不同程度的影响。近年来国外文献关于凝血因子ⅦR353Q基因多态性与脑瘫发生的相关性报道存在争议[4-5]。本研究采用聚合酶链式反应与限制性片断长度多态性(polymerase chain reaction-restricted fragment length polymorphism, PCR-RFLP)分析方法，对凝血因子Ⅶ基因第8外显子的R353Q基因多态性进行检测，探讨R353Q基因多态性与脑瘫发病的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2012年3月～2013年1月在佳木斯大学附属第三医院门诊或住院的脑瘫患儿160例，其中男性82例，女性78例；年龄1.13～12.35岁，平均(3.47±2.54)岁，均为汉族。诊断均符合2006年长沙第二届全国儿童康复学术会议标准[6]，除外单纯精神发育迟滞、中枢神经系统感染性疾病、注意缺陷多动障碍、癫痫、已确诊为染色体异常或其他神经系统器质性疾病患儿。选择佳木斯市幼儿园和小学就读的健康儿童137名为对照组，其中男性70名，女性67名；年龄1.47～12.55岁，平均(4.48±2.59)岁，均为汉族。所有参与研究者的监护人均签署知情同意书。

1.2 R353Q基因多态性检测

采集静脉血2 ml，加EDTA抗凝剂后保存于-80°冰箱中。用全血DNA提取试剂盒(大连宝生物公司)提取DNA，置-80°冰箱保存。

PCR扩增采用PCR-RFLP法，特异性扩增R353Q基因序列，产物片段为312 bp。引物序列如下：

上游：5'-GGG AGA CTC CCC AAA TAT CAC-3'，

下游：5'-ACG CAG CCT TGG CTT TCT CTC-3'，

由Invitrogen公司合成。

PCR反应体系：总体积20 μl，其中模板DNA 0.5 ng、引物(10 pmol/L)各0.4 μl、dNTP(各2.5 mmol/L) 1.6 μl、10×PCR buffer 2 μl，金牌Taq酶0.5 U，加入双蒸水至20 μl。

反应条件：95℃预变性10 min，95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s，共30个循环，最后72℃延伸8 min。

取PCR产物8 μl，HhaⅠ1 μl、酶解反应缓冲液2 μl，蒸馏水9 μl，总反应体系20 μl，于37℃水浴4 h；取酶切产物20 μl，8%非变性聚丙烯酰胺凝胶500 V电泳1 h，溴化乙锭染色，紫外灯下观察。

1.3 统计学分析

实验数据采用SPSS 18.0统计软件进行分析。组间基因型及等位基因分布采用χ2检验，基因型及等位基因与疾病关系的关联强度OR值其95%CI估计；按Hardy-Weinberg平衡定律进行群体平衡验证。

2 结果

2.1 电泳结果和基因型分析

R353Q多态性扩增片段大小为312 bp。经限制性内切酶消化可产生3种基因型：当基因型为RR型时，可被酶切成205 bp、67 bp、40 bp三个片段；当基因型为RQ型时，可被酶切为272 bp、205 bp、67 bp、40 bp四个片段；当基因型为QQ型时，可被酶切为272 bp、67 bp、40 bp三个片段。由于40 bp、67 bp片断太小，电泳时不可见。见图1。

图1 R353Q基因酶切产物琼脂糖电泳结果

2.2 R353Q多态分布

经χ2检验，脑瘫组和对照组人群R353Q基因型分布符合Hardy-weinberg平衡(P＞0.05)。见表1。

两组间三种基因型及R和Q等位基因分布均无显著性差异(P＞0.05)。见表2。

表1 两组R353Q多态分布的Hardy-Weinberg检验(n)

表2 两组R353Q基因型及其等位基因分布

3 讨论

据脑瘫研究登记(Cerebral Palsy Research Registry, CPRR)最新报道，美国约有76.4万名脑瘫患者，每年大约有8000名婴幼儿被诊断为脑瘫[7]。传统观点认为，围产期原因是导致脑瘫的主要原因；近来认为，70%～80%的脑瘫发生于出生前[8]，其中相当大的比例原因不明。因此，近年认为对脑瘫病因学的研究应转入胚胎发育生物学的范畴。尽管围生医学迅速发展，足月脑瘫儿的发生率并没有降低[9]，这使得人们越来越重视遗传因素在脑瘫中的意义。Lang等对亚洲脑瘫患儿的病例资料研究发现，脑瘫病因中，遗传因素可占到40%[10]。遗传因素可能决定神经损伤的严重程度、预后及临床表现[11]。

凝血因子Ⅶ基因定位于13号染色体长臂(13q)，目前认为，位于第8外显子的R353Q碱基变异最为常见；R353Q基因的多态性会对凝血因子Ⅶ活性产生不同程度的影响。目前研究认为，凝血因子Ⅶ可能是缺血性脑血管病的危险因素。Hanson等研究发现，血浆凝血因子Ⅶc水平升高是缺血性脑血管病发病的风险因素，而血浆凝血因子Ⅶc水平与R353Q基因型紧密相关：RR基因型患者最高，RQ基因型次之，QQ基因型最低[12]。

本研究显示，R353Q基因多态性与中国汉族儿童脑瘫的发病无显著相关性，不是脑瘫发病的遗传易感因子。但这并不排除上述位点在脑瘫发病中与其他危险因子可能具有协同作用，从而导致脑瘫。此外，R353Q基因多态性与脑瘫的关系是否受到性别、地区、民族等因素的影响，还值得我们进一步研究。Adams等发现，母亲和胎儿的基因型可能共同决定怀孕时间，与早产的发生有关，进而导致不同程度脑损伤，从而引起脑瘫[13]。

[1]李晓捷.实用小儿脑性瘫痪康复治疗技术[M].北京:人民卫生出版社,2009.

[2]Morris C.Definition and classification of cerebral palsy：a historical perspective[J].Dev Med Child Neurol Suppl,2007, 109:3-7.

[3]李树春.小儿脑性瘫痪[M].郑州:河南科学技术出版社,2000.

[4]Malhotra A,Veldman A.Recombinant activated Factor VII for prevention and treatment of intraventricular haemorrhage in neonates[J].The Cochrane Library,2011-03-16.DOI:10.1002/ 14651858.CD009032.

[5]Nelson KB,Dambrosia JM,Iovannisci DM,et al.Genetic polymorphisms and cerebral palsy in very preterm infants[J].Pediatr Res,2005,57(4):494-499.

[6]陈秀洁,李树春.小儿脑性瘫痪的定义、分型和诊断条件[J].中华物理医学与康复杂志,2007,29(5):309.

[7]脑瘫研究登记网.https://www.cpregistry.org/index.php

[8]Senbil N,Yüksel D,Yilmaz D,et al.Prothrombotic risk factors in children with hemiplegic cerebral palsy[J].Pediatr Int, 2007,49(5):600-602.

[9]Wanigasinghe J,Reid SM,Mackay MT,et al.Epilepsy in hemiplegiccerebralpalsy due to perinatalarterialischaemic stroke[J].Dev Med Child Neurol,2010,52(11):1021-1027.

[10]Lang TC,Fuentes-Afflick E,Gilbert WM,et al.Cerebral palsy among asian ethnic subgroups[J].Pediatrics,2012,129(4): e992-e998.

[11]Wright A.Neurogenetics II:complex disorders[J].Neurol Neurosurg Psychiatr,2005,76(5):623-631.

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[13]Adams KM,Eschenbach DA.The genetic contribution towards preterm delivery[J].Semin Fetal Neonatal Med,2004,9 (6):445-452.

Relationship between Gene Polymorphism of Factor VII R353Q and Cerebral Palsy for Han Chinese Children

LI Xiao-jie,XU Lei, KANG Bei-bei.Rehabilitation Medicine College of Jiamusi University,Children Neural Rehabilitation laboratory of Jiamusi University,Jiamusi 154002,Heilongjiang,China

ObjectiveTo investigate the relationship between gene polymorphism of factor VII R353Q(FVII R353Q)and cerebral palsy for Han Chinese children.MethodsPolymerase chain reaction-restricted fragment length polymorphism were used to determine genotype and allele of R353Q gene in 160 children with cerebral palsy and 137 normal children.ResultsThe genotype of FVII R353Q is close to Hardy-Weinberg equilibrium in both CP group and control group(P＞0.05).There was not significant difference in the distribution of the allelic frequency and genotype of FVII R353Q between the both groups(P=0.436,P=0.182,respectively).ConclusionThe gene polymorphism of FVII R353Q is not significantly related with cerebral palsy for Han Chinese children.

cerebral palsy;Han;factor VII R353Q;gene polymorphism

R742.3

A

1006-9771(2013)09-0878-03

2013-04-26

2013-05-27)

1.黑龙江省研究生创新科研资金项目(No.YJSCX2012-358HLJ)；2.佳木斯大学科学技术面上项目(No.L2012-032)。

1.佳木斯大学康复医学院，黑龙江佳木斯市154002；2.佳木斯大学儿童神经康复实验室，黑龙江佳木斯市154002。作者简介：李晓捷(1951-)，女，黑龙江延寿县人，主任医师，教授，主要从事小儿脑损伤发病机制及早期防治研究。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.09.023