陈 雷 刘新亮 王欢利 汪贵斌 陈柳馨 曹福亮

(南京林业大学，南京，210037)

银杏(Ginkgo biloba)原产于我国，是我国的重要经济林以及观赏树种。它既可作为园林绿化树种，也是优良用材树种，特别是叶片中富含两种重要的次生代谢产物——黄酮类和萜类化合物，具有极高的药用价值［1］。通过植物组织培养技术快速大量的扩繁银杏愈伤组织，进而获取银杏次生代谢产物具有极其广阔的发展前景。组织培养作为一种加速繁育速度，缩短育种周期的无性繁殖手段，广泛地用于各类植物中［2］。同时，组织培养所获得的愈伤组织也是次生代谢物生产的理想材料，因此，对银杏愈伤组织的研究存在着重大意义。迄今为止，现有对银杏愈伤组织培养的研究多集中在器官组织培养［3－4］、培养基及外源激素选择［5－7］等方面，但是，微量元素对银杏愈伤组织诱导及生长的影响的研究尚未见报道。因此，文中采用切除胚根的成熟胚作为外植体，在含有不同种类及质量浓度微量元素的MS 培养基上，诱导愈伤组织产生和生长，旨在找到最优的微量元素组合，并揭示影响愈伤组织产生和生长的主要影响元素，为银杏愈伤组织的诱导及细胞悬浮培养体系建立提供理论基础。

1 材料与方法

银杏种子采自泰兴30年生佛指银杏，采摘去外种皮后种核在冰箱中4 ℃保存。接种前，种核用0.1%升汞消毒8 min，无菌水清洗5 次，每次10 min。在超净工作台上将切去胚根的成熟胚接种于含有不同种类及质量浓度微量元素的MS +NAA 1.5 mg·L－1+6 －BA 2 mg·L－1+蔗糖35 g·L－1+琼脂7.5 g·L－1培养基。

本试验主要为考察MS 培养基中微量元素Mo、B、Mn、Cu、Co 质量浓度变化对胚愈伤的影响，采用L16(45)正交设计，每个因子分为4 个水平。设计的因子水平如表1所示，其中，水平2 为标准MS 培养基所添加值。总计配成A1B1C1D1E1、A1B2C2D2E2、A1B3C3D3E3、A1B4C4D4E4、A2B1C2D3E4、A2B2C1D4E3、A2B3C4D1E2、A2B4C3D2E1、A3B1C3D4E2、A3B2C4D3E1、A3B3C1D2E4、A3B4C2D1E3、A4B1C4D2E3、A4B2C3D1E4、A4B3C2D4E1、A4B4C1D3E2，其中1、2、3、4 分别代表各因子相对应的4 个水平。每个处理6 ～10 瓶，每瓶接种3 株。

表1 正交试验设计 mg·L －1

愈伤组织诱导率测定:胚接种7 d 后计算愈伤组织的诱导率。以出现肉眼可见的愈伤组织记为外植体的愈伤发生时间，40 d 后统计愈伤组织的褐化率。

愈伤组织的诱导率=(出现愈伤组织的外植体数/总的接种外植体数)×100%。

褐化率=(褐化的愈伤数/愈伤总数)×100%。

愈伤组织生长量的测定:培养35 d 后，将愈伤组织从培养瓶中取出，用电子天平称其鲜质量，其中:愈伤组织生长量=培养后愈伤组织鲜质量－接种时鲜质量。

试验数据利用Excel、SAS 统计分析软件进行处理，并用Duncan 法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 微量元素对银杏愈伤组织诱导率、褐化率及生长量的影响

在接种后，平均培养4 d 便可观察到明显的银杏愈伤组织。正交设计方差分析如表2所示。方差分析表明，不同微量元素质量浓度显著影响了银杏胚愈伤组织诱导率(p ＜0.01)。从表3的多重对比结果可以看出，当Na2MoO4·2 H2O 添加量达到1.250 mg·L－1时，银杏愈伤组织诱导率达到85.84%，显著高于其他水平。这也说明过高或者过低的Na2MoO4·2H2O 质量浓度会抑制愈伤组织诱导。而对于B 元素来说，高质量浓度的H3BO3并不会抑制愈伤组织诱导，反而能够起到促进作用，在H3BO3添加量达到24.800 mg·L－1时，愈伤组织诱导率达到最大值，为81.99%。显著高于最低质量浓度水平(3.100 mg·L－1)，然而与其他两质量浓度间并不存在显著差异。试验中，最低质量浓度的MnSO4·4H2O 并不利于银杏愈伤组织诱导，然而当MnSO4·4H2O 添加量达到22.300 mg·L－1时，其诱导率达到81.81%，然而，继续提高添加量并不能显著改变愈伤组织诱导率。银杏愈伤组织诱导率随着CuSO4·5H2O 添加量的上升而上升，但是在0. 025、0.250、0.500 mg·L－13 个水平下并无显著差异。与Na2MoO4·2H2O 相似，高质量浓度或者低质量浓度的CoCl2·6H2O 抑制了银杏愈伤组织诱导。但是，在0.025、0.125 mg·L－1水平下并无显著差异。

表2 微量元素处理对银杏愈伤组织诱导率、褐化率及生长量正交设计方差分析

褐化是植物愈伤组织培养过程中常见的现象。方差分析表明，除了Cu 元素外。其他微量元素质量浓度对银杏愈伤组织褐化产生了极为显著的影响(p ＜0.01)。从表3可知，银杏愈伤组织褐化率随着Na2MoO4·2H2O 质量浓度的上升而上升，但是却随着H3BO3和MnSO4·4H2O 质量浓度的上升呈现下降趋势。而对CuSO4·5H2O 来说，过高和过低的质量浓度均会导致褐化率的上升，但是CuSO4·5H2O 的质量浓度对愈伤组织褐化率的影响并没有达到极为显著水平(0.01 ＜p ＜0.05)。与CuSO4·5H2O 相反，高质量浓度和低质量浓度的CoCl2·6H2O 元素却能抑制银杏愈伤组织的褐化。

银杏愈伤组织生长量是评价细胞培养体系优劣的重要因素。微量元素的质量浓度显著影响了银杏愈伤组织生长量(p ＜0.01)。从表3中可以看出:银杏愈伤组织生长量随着Na2MoO4·2H2O 质量浓度的上升而减少，在Na2MoO4·2H2O 添加量上升到3.750 mg·L－1时，愈伤组织生长量仅为14.89 g，显著低于其他水平。但是，愈伤组织生长量随着H3BO3和CuSO4·5H2O 质量浓度的上升而上升，在质量浓度最大时，银杏愈伤组织生长量达到最大值，分别为18.07、20.03 g，显著高于低质量浓度下的生长量。同样，与两高质量浓度水平相比，低质量浓度的MnSO4·4H2O 和CoCl2·6H2O 元素也会抑制愈伤组织生长。

表3 微量元素处理对银杏愈伤组织诱导率、褐化率及生长量的影响

表4 微量元素处理组合对银杏愈伤组织诱导率的影响

2.2 不同微量元素质量浓度组合对银杏愈伤组织诱导率、褐化率及生长量的影响

从表4可以看出，组合A3B4C2D1E3、A2B2C1D4E3、A3B1C3D4E2、A4B4C1D3E2和A1B3C3D3E3的愈伤组织诱导率显著高于其他组合，其中，A3B4C2D1E3的愈伤组织诱导率达到了96. 08%，而最低的A2B1C2D3E4仅为61.75%。从极差值R(表5)直观分析可知，试验所考察的5 个因素中，Co 对愈伤组织诱导率的影响最大，Cu 的影响最小。不同微量元素对银杏愈伤组织诱导率的影响由大到小的顺序为Co、Mo、Mn、B、Cu。

愈伤组织褐化率最低的是A1B4C4D4E4，这个处理中并没有观察到褐化;而褐化率最高的是A3B1C3D4E2，达 到 了 24. 83%，然 而 与 处 理 A4B4C1D3E2、A4B3C2D4E1、A3B3C1D2E4、A2B3C4D1E2、A4B1C4D2E3间并不存在显著差异(p ＜0.01)。从极差值R(表5)直观分析可知，试验所考察的5 个因素中，Mo 对愈伤组织褐化的影响最大，Cu 的影响最小。不同元素对银杏愈伤组织褐变的影响由大到小的顺序为Mo、B、Co、Mn、Cu。

表5 极差分析

通过正交试验可以看出，愈伤组织生长量最高的是A1B4C4D4E4，达到了24. 39 g，最低的是组合A1B1C1D1E1，仅为8.09 g，两者相差达到了16.30 g，其差异极为显著(p ＜0.01)。在所有处理中，处理组 合 A1B4C4D4E4、A2B2C1D4E3、A1B3C3D3E3和A4B3C2D4E1的愈伤组织生物量显著高于其他处理，并达到了极显著水平(p ＜0.01)。从极差值R(表5)直观分析可知，试验所考察的5 个因素中，Cu 对愈伤组织鲜质量的影响最大，Mo 的影响最小。不同元素对银杏愈伤组织鲜质量的影响由大到小的顺序为Cu、B、Co、Mn、Mo。

3 结论与讨论

植物愈伤组织生长过程中，受多种因素的影响。微量元素是植物生长发育过程中必不可少的营养成分，在植物生理过程中起着非常重要的作用。硼能促进生长素的运转，提高植物的抗逆性;钼能促近光合作用的强度以及活性铝的毒害作用;铜催化植物的氧化还原反应，与叶绿素形成有关;锰提高植物的呼吸强度，是许多酶的活化剂，有利于蛋白质的合成;钴能改善生长、蒸腾和光合作用，使叶绿素含量得以提高［8－9］。研究表明，不同微量元素对愈伤组织的影响各不相同。一般认为过高的微量元素对愈伤组织存在毒害作用，而低质量浓度的微量元素又阻碍愈伤组织生长。只有适宜的微量元素组合能够有效的促进愈伤组织分化及生长，降低愈伤组织褐化率，并增加组织中次生代谢产物。而这个值对不同植物来说显然存在一定差异。而也有研究认为微量元素的差异对愈伤组织的诱导影响不大，对于褐化程度的控制有较为明显的影响，随着微量元素的质量浓度升高，愈伤组织的褐化率先升后降［10］。微量元素对银杏愈伤组织诱导及生长的影响尚未见报道。

从多重对比来看，银杏愈伤组织诱导最佳的微量元素质量浓度分别为:Na2MoO4·2H2O 1.250 mg·L－1、H3BO324.800 mg·L－1、MnSO4·4H2O 22.300 mg·L－1、CuSO4·5H2O 0. 500 mg·L－1、CoCl2·6H2O 0.125 mg·L－1;而银杏愈伤组织生长量最大的微量元素质量浓度分别为Na2MoO4·2H2O 0.125 mg·L－1、H3BO324.800 mg·L－1、MnSO4·4H2O 44.600 mg·L－1、CuSO4·5H2O 0. 500 mg·L－1、CoCl2·6H2O 0.125 mg·L－1;褐化率最低的微量元素质量浓度 分 别 为:Na2MoO4·2H2O 0. 125 mg·L－1、H3BO324.800 mg·L－1、MnSO4·4H2O 22.300 mg·L－1、CuSO4·5H2O 0.025 mg·L－1、CoCl2·6H2O 0.250 mg·L－1。但是，这些元素组合是否为最佳组合仍然有待进一步研究。

而在本试验中，处理A3B4C2D1E3愈伤组织诱导率最高;愈伤组织褐化率最低，以及最有利于银杏愈伤组织生长的组合为A1B4C4D4E4。这也说明了高质量浓度的微量元素B、Mn、Cu、Co 组合能有效降低愈伤组织的褐化率。然而，之前的研究表明，培养基中无机盐质量浓度过高可引起酚类分泌物大量产生，导致外植体褐变［10］，降低无机盐的质量浓度能有效地减少褐化的发生，降低褐化率［11－12］。本试验中，高质量浓度的Na2MoO4·2H2O 的确增加愈伤组织褐化率，但是其他微量元素的增加反而降低了愈伤组织褐化，可能的原因在于培养基中这几种微量元素的质量浓度较低，其质量浓度的变化对培养基总体无机盐质量浓度影响较小，不能有效地影响褐化现象，各处理对愈伤组织褐化的影响差异不明显。试验发现，不同类型和水平的微量元素对愈伤组织的生长影响达到极显著水平，当微量元素质量浓度较低时，银杏愈伤组织的生长较差，鲜质量较低。这是因为微量元素质量浓度较低时，培养基中营养不足，从而影响愈伤组织的发育，降低了愈伤组织的生长量。当各微量元素质量浓度增加时，愈伤组织的鲜质量出现了不同程度的增加。这说明，增加一定的微量元素质量浓度，有利于愈伤组织的生长。

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