周 哲 吴稼晟 张 明 赵 阳 周 娟 李 伟 王 忠 孙 康 卢慕峻

人脂肪来源干细胞与聚己内酯/壳聚糖支架的生物相容性研究

周 哲 吴稼晟 张 明 赵 阳 周 娟 李 伟 王 忠 孙 康 卢慕峻

目的观察人脂肪来源干细胞（Human adipose derived stem cells，hADSCs）在聚己内酯/壳聚糖[Poly(ε-caprolactone)/chitosan，PCL/CS]支架中的生长情况。方法取PCL/CS浸提液培养hADSCs，CCK-8法检测细胞活力，评价支架细胞毒性。hADSCs传代扩增后，接种到PCL/CS支架上，体外培养1周、2周，裸鼠体内培养2周，HE染色观察细胞在支架上的生长情况，免疫组化HLA-Ⅰ监测经裸鼠体内培养后复合支架上细胞的种属来源。结果hADSCs在PCL/CS浸提液中可保持较高的增殖率，PCL/CS浸提液无细胞毒性。hADSCs终止于PCL/CS支架后，经过体外、内培养，hADSCs均能长入支架的空隙内，且体内培养比体外培养有更多的细胞长入支架。体外培养1周，已有细胞黏附生长在PCL/CS支架的边缘，体外培养2周后，部分细胞渗透到材料内部。体内培养2周后，大量细胞能渗透到材料内部，同时HLA-Ⅰ抗体检测发现，支架材料内部分细胞HLA-Ⅰ阳性表达，说明PCL/CS支架内该部分的细胞来源于hADSCs。结论PCL/CS支架安全无毒，hADSCs能在PCL/CS支架上较好生长，该支架可用于组织工程膀胱的研究。

人脂肪来源干细胞聚己内酯壳聚糖支架组织工程

大面积膀胱缺损的修复一直是临床面临的难题，组织工程技术修复大面积膀胱缺损已成为目前的研究热点。脂肪来源干细胞（Human adipose derived stem cells，hADSCs）具有自我更新及多向分化潜能，较易获得，适合作为组织工程膀胱修复的种子细胞。聚己内酯[Poly(ε-caprolactone)，PCL]是由ε-己内酯开环聚合所得到的线性脂肪族聚酯，具有良好的生物降解性和生物相容性，具备一定的力学强度和药物通过性[1]。壳聚糖（Chitosan，CS）结构与细胞外基质中的主要成分糖胺聚糖十分类似，也是现今所发现的惟一具有明显碱性、带有正电荷的天然多糖[2]。研究表明，联合CS的生物活性及PCL的机械性能制造出的复合支架，比单一成分支架具有更好的亲水性、生物活性和机械强度[3-5]。

本实验将hADSCs置于PCL/CS浸提液中培养，检测PCL/CS的细胞毒性，并将hADSCs种植于PCL/CS支架上，进行体外、体内培养，观察细胞生长情况，探讨PCL/CS作为hADSCs的支架材料用于组织工程膀胱缺损的修复的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

hADSCs取自人抽脂术后废弃的脂肪组织。PCL（SOLVAY公司），CS（国药集团化学试剂有限公司），PCL/CS复合支架由上海交通大学材料科学与工程学院制作。兔抗人HLA-Ⅰ抗体（Epitomics公司）。

1.2 方法

1.2.1 hADSCs的分离培养

将抽脂术后废弃的人脂肪组织，洗去血细胞和麻醉液。加入等体积的0.1%的胶原酶Ⅳ，37℃恒温振荡消化1 h；离心去除悬浮的脂肪和上清液，含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基重悬细胞，置于37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中进行单层细胞培养。48 h后更换培养液1次，以后每3天换液1次。6～8 d细胞生长融合达80%～90%后，0.5%胰酶-EDTA消化，按1:3进行传代培养。

1.2.2 PCL/CS支架的制备及扫描电镜观察

将CS与PCL按照质量以2:8混合后，与过筛后的氯化钠（粒径约为50～120 μm）按照体积百分比1:9混合，在转矩流变仪中共混，共混温度为140℃。共混物在平板硫化机上压模成型,放入去离子水浸泡，真空冷冻干燥后，得到PCL/CS多孔支架。

将上述方法制备得到的PCL/CS支架喷金镀膜，在液氮中脆断，喷金处理，扫描电镜观察。

1.2.3 支架材料孔隙率测量

将制备的PCL/CS烘干，分析天平精确称重后，计算PCL/CS孔隙率。

1.2.4 hADSCs在PCL/CS浸提液中增殖率的测定

PCL/CS支架以75%乙醇浸泡消毒过夜；洗去残留乙醇，加入DMEM培养基，置37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中24 h，收集浸提液。取增殖能力较强的第3代hADSCs，接种于96孔板中培养。24 h后吸出培养基，分别添加100 μL DMEM培养基（对照组）和PCL/CS浸提液（实验组），继续培养。于第1、3、7天，每组各取5个孔，每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养1 h后，酶标仪测定450 nm波长时的A值，计算相对增殖率，进行毒性分级。

1.2.5 hADSCs种植于PCL/CS支架

将消毒后的PCL/CS支架裁成10 mm×10 mm大小，PBS冲洗，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基预培养过夜。吸弃上清及材料表面的培养基，选取生长良好的第3代hADSCs，制成密度为2×106cells/mL的细胞悬液，每个材料表面均匀滴加1 mL细胞悬液，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，置于37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中。用于体内试验的细胞材料复合物，在体外培养3 h后，植入裸鼠皮下。用于体外实验的支架，继续在培养箱中培养，3 d换液一次。

1.2.6 组织学观察

体外培养的细胞－支架复合物于培养后1周、2周取材，体内培养的于培养后2周取材，4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脱水，石蜡包埋，切片（6 μm厚），HE染色，光镜下观察细胞在支架内的生长情况。

1.2.7 体内培养的细胞－支架复合物免疫组化检测

体内培养的细胞－支架复合物于2周后取材，石蜡切片，3%过氧化氢溶液去除内源性过氧化物酶，0.1%胰酶修复抗原，滴加羊血清封闭非特异性抗原。一抗为兔抗人HLA-Ⅰ抗体，4℃过夜。二抗为偶联过氧化物酶的羊抗兔单克隆抗体，DAB显色。苏木素衬染细胞核，1%盐酸乙醇分化，95%～100%乙醇脱水，二甲苯透明处理，中性树胶封片。

1.2.8 统计学分析

SPSS17.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差表示。实验组与对照组各时间点A值的比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hADSCs的形态和生长特性

原代细胞培养6 h后，已有部分成纤维细胞样细胞贴壁。贴壁细胞呈梭形，其间也可见少量三角形、多边形细胞（图1A）。随着培养时间的延长，贴壁细胞呈集落状生长，集落大小不一，含数个至数百个细胞不等，集落中细胞形态为典型的梭形细胞。培养6～8 d细胞可达80%～90%融合，9～10 d可形成100%融合的致密单层。传代后的细胞形态主要为梭形，少数为三角形或多边形（图1B）。流式细胞鉴定示，CD29表达为99.77%，CD44表达为97.1%，CD73表达为96.54%，CD105表达为93.06%，CD45表达为0.37%，CD34表达为1.38%[6]。上述结果表明，我们分离得到的细胞是hADSCs。

图1 hADSCs形态学观察（40×）Fig.1Histological observation of hADSCs(40×)

2.2 支架材料的制备

制备的PCL/CS多孔支架外观呈白色（图2A），扫描电镜观察孔径为100 μm左右（图2B），孔隙率为88.76%，与理论值（约90%）相似。

图2 PCL/CS支架材料大体观及扫描电镜观察Fig.2Gross observation and SEM observation of PCL/CS

2.3 hADSCs在PCL/CS浸提液中增殖率的测定

第1、3、7天实验组细胞的相对增殖率分别为98.6%、101.6%和110.3%，平均相对增殖率为103.5%，和对照组无显著差异（P＞0.05），说明浸提液对细胞增殖无明显影响，浸提液在第1、3、7天的细胞毒性分别为Ⅰ级、0级和0级，说明细胞在浸提液中可保持良好的增殖，PCL/CS浸提液无细胞毒性。

2.4 细胞在支架上的生长情况

接种hADSCs于体外、体内培养后，支架无明显收缩。组织学检测结果显示，体外、体内培养的细胞－支架复合物中，hADSCs均能长入支架孔隙内，且体内培养比体外培养有更多的细胞长入。体外培养1周，已有细胞黏附生长在PCL/CS支架的边缘；体外培养2周后，部分细胞渗透到支架内部；体内培养2周后，大量细胞能渗透到支架内部。同时HLA-Ⅰ抗体检测发现，支架内细胞阳性表达（图3）。

图4 hADSCs复合PCL/CS支架组织学检测及免疫组化检测（200×）Fig.4Morphological observation and immunohistochemical observation of PCL/CS scaffold compound with hADSCs(200×)

3 讨论

组织工程膀胱缺损的修复主要涉及平滑肌细胞（Smooth muscle cell，SMC）和尿路上皮细胞（Urothelial cell，UC）。研究表明，ADSCs通过体内外诱导能够向SMC分化，表达平滑肌特异性的标志物并具备收缩和舒张的功能，可用于修复膀胱肌层缺损[7-11]；ADSCs还能向UC表型分化[6，12-13]。ADSCs具有来源丰富、取材方便及对患者损伤小等优势，已成为组织工程膀胱修复的理想种子细胞。

组织工程支架材料应具有良好的组织相容性、机械和物理性能，并可按预期设计的时间降解和吸收，降解产物无毒性[14]。我们前期分别用脱细胞基质（BAMG）和人工合成材料（PGA）作为支架材料，进行膀胱壁复层结构的体外构建[15-16]。发现BAMG支架材料机械强度较好，但支架内部细胞渗透性较差。单纯PGA材料虽然具有良好的生物相容性、可降解性和可塑性等优点，但降解时间较短，机械强度较差，其酸性降解产物可影响种子细胞的活力。单纯来源支架材料的缺陷促使近年来复合支架材料的研究成为趋势[17-20]。PCL具有良好的生物降解性、力学性能、药物通过性和生物相容性，降解产物对人体无毒。但PCL具有高度疏水性，缺乏生物活性。CS作为一种天然细胞外基质，具有良好的生物相容性和促进体内细胞黏附和增殖的优点，能够有效弥补单纯PCL支架材料的缺陷。研究表明，联合壳聚糖的生物活性及PCL的机械性能制备的复合支架，比单一成分支架具有更好的生物学和机械性能。PCL/CS与多种细胞都具有良好的生物相容性，是较为理想的支架材料[5，21-22]。

本实验将hADSCs在PCL/CS浸提液中培养1、3、7 d，结果显示各时间点实验组和对照组A值无显著性差异（P＞0.05）。说明PCL/CS浸提液不存在明显的细胞毒性。hADSCs种植于PCL/CS支架后，经体外、体内培养，细胞均能长入PCL/CS支架的孔隙内，说明PCL/CS支架具有良好的细胞亲和性，进一步说明了PCL用CS修饰后，其疏水性能得到较大改善，有利于细胞的黏附生长。体内培养比体外培养有更多的细胞长入支架，可能是由于体内环境为细胞生长提供了丰富的血供和营养。体外培养1周时，已有细胞黏附生长在PCL/CS支架的边缘；2周后，部分细胞渗透到材料内部，细胞数量明显增多，这可能是细胞在材料内部扩增的结果，hADSC体外传代扩增时间为5 d左右，1周后细胞在支架上可以实现倍增。体内培养2周后，大量细胞能渗透到材料内部，同时细胞周围可见大量细胞外基质；HLA-Ⅰ抗体检测发现，支架材料内部分细胞阳性表达，说明PCL/CS支架内的细胞来源于人，即hADSCs。体内外构建结果表明，PCL/CS复合材料适合ADSCs的黏附、生长和增殖。

本实验结果表明，PCL/CS复合支架材料安全、无毒，ADSCs能在PCL/CS支架上较好地黏附和增殖，有望进一步用于体内组织工程膀胱修复的研究。

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Experimental Study on Human Adipose-Derived Stem Cells Co-cultured with Poly(ε-Caprolactone)/Chitosan Scaffold

ZHOU Zhe1,WU Jiasheng2,ZHANG Ming1,ZHAO Yang1,ZHOU Juan1,LI Wei2,WANG Zhong1,SUN Kang2,LU

Mujun1.1 Department of Urology,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011,China;2 State Key Lab of Metal Matrix Composites,Shanghai Jiaotong University School of Materials Science and Engineering,Shanghai 200240,China.Corresponding author:LU Mujun(E-mail:lumujun@163.com).

ObjectiveTo observe the growth of human adipose derived stem cells(hADSCs)cultured with Poly(εcaprolactone)/chitosan biomaterials in vitro and in vivo.MethodshADSCs were isolated from human subcutaneous adipose tissue after collagenase digesting,filtrating and centrifuging.The scaffold was prepared by freeze-drying technique and the method of vacuum thermal cross-linking and it's cytotoxicity was evaluated by CCK-8 reagent tests.Then the hADSCs of passage 3 were seeded onto the PCL/CS scaffolds and the growth of hADSCs cultured in PCL/CS biomaterials was observed by HE staining.The cells in the scaffolds cultured in vivo were detected by immunohistochemistry.ResultshADSCs could maintain high increment rate in the leaching solution of the PCL/CS and the PCL/CS scaffolds were non-toxic.The histological study found that hADSCs could grow into the space of the PCL/CS scaffolds after cultured in vitro and in vivo, and there were more cells in the scaffolds cultured in vivo than in vitro.When cultured in vitro,some cells adhered at the edge of the PCL/CS 1 week later and more cells grew into the inside of the scaffolds after 2 weeks.When cultured in vivo,a great deal of cells grew into the scaffolds,and immunohistochemistry results suggested that the cells inside the scaffolds were hADSCs.ConclusionPCL/CS scaffolds are non-toxic and have a good biocompatibility with hADSCs,which can be used as a vehicle for hADSCs in bladder defect reconstruction.

Human adipose derived stem cells;Poly(ε-caprolactone);Chitosan;Scaffold;Tissue engineering

Q813.1+2

A

1673－0364（2013）03－0133－04

2013年4月6日；

2013年4月28日）

国家自然科学基金项目（81070605）；上海交通大学“医工（理）交叉研究基金”（YG2011MS14）；上海市教委科研创新项目（09YZ76）。

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院泌尿外科（周哲，张明，赵阳，周娟，王忠，卢慕峻）；200240上海市上海交通大学材料科学与工程学院金属基复合材料国家重点实验室（吴稼晟，李伟，孙康）。

卢慕峻（E-mail：lumujun@163.com）。

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.03.004