曹小芳 毕晓云 王勇奇 李志勇 陈晶砺 黄 舒 郭子宽 王恒湘

高迁移组蛋白1-A盒对大鼠胶原诱导的关节炎的治疗作用

曹小芳 毕晓云 王勇奇 李志勇 陈晶砺 黄 舒 郭子宽 王恒湘

目的探讨高迁移组蛋白1-A盒（A-box of high mobility group protein-1，A-BOX）对类风湿性关节炎的治疗作用。方法以胶原诱导的关节炎（Collagen-induced arthritis，CIA）大鼠模型为研究对象，在胶原造模4周后，进行关节炎症状评分，并将实验动物随机分为三组（每组12只），腹腔内分别注射A-BOX（每只大鼠注射0.62 mg，A-BOX组）、甲氨蝶呤（1 mg/Kg，MTX组）和生理盐水（阴性对照组），每周一次，连续治疗4周。治疗后进行关节炎症状评分、踝关节病理学及X线摄片检查。结果所有造模大鼠均出现了关节炎症状，造模后关节炎评分为（7.25±0.70），显著高于正常大鼠（P＜0.01）。治疗4周后，阴性对照组症状评分为（7.77±0.44），显著高于MTX组（6.25±1.03）（P＜0.05）和A-BOX组（6.12±0.99）（P＜0.01）。MTX组与A-BOX组无显著差异（P＞0.05）。病理学显示，A-BOX组滑膜增生、血管新生和炎症评分分别为（0.00±0.00），（1.14±0.69）和（1.71±0.75）；MTX组分别为（0.71±0.48），（1.57±0.78）和（1.42±0.53），均显著低于阴性对照组的（2.28±0.45），（1.85±0.69）和（2.14±0.89）（P＜0.05）。A-BOX组未见滑膜增生，评分低于MTX组（P＜0.05）；两组间其他改变无显著差异（P＞0.05）。X线摄片A-BOX组、MTX组及阴性对照组评分分别为（1.85±1.06），（1.85±1.06）和（3.28±0.48），均有统计学差异（P＜0.05）。结论A-BOX对大鼠CIA治疗作用稍优于MTX，具有药物开发前景。

高迁移率族蛋白1-A盒甲氨蝶呤胶原诱导的关节炎

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是关节滑膜炎症导致关节破坏的慢性全身性疾病[1]，以慢性、进行性、对称性和多关节炎症为主要表现[2]，基本病理特征是滑膜组织炎性增生，伴关节软骨和骨组织的破坏[3]。高迁移率族蛋白B1（High mobility group protein-1，HMGB1）是HMG家族成员之一，广泛存在于各型细胞的胞核和胞质中[4]。研究表明，HMGB1作为一种重要的晚期炎症介质，在多种急慢性炎症中均有表达[5]，是多种疾病发生、发展过程中关键的因素之一[6]。RA的突出细胞学特征为细胞坏死和巨噬细胞活化[7]。患者血浆中可检测到高水平HMGB1，是受累关节滑膜液中单核巨噬细胞在致炎因子刺激下释放HMGB1，同时受HMGB1刺激而释放致炎因子，构成炎症放大效应的结果。HMGB1主要由A-BOX、B-BOX及酸性尾端组成，其中BBOX具有促炎作用，A-BOX可以拮抗HMGB1的炎性作用[8]。我们既往的研究表明，A-BOX可以抑制T淋巴细胞增殖，也可促进间充质干细胞向成骨细胞分化[9]。由此设想，利用A-BOX拮抗HMGB1的致炎效应可能成为RA治疗的新策略。为此，我们建立胶原诱导关节炎（Collagen-induced arthritis，CIA）大鼠模型，与甲氨蝶呤（Methotrexate，MTX）比较，观察ABOX的治疗效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及来源

Wistar雄性大鼠，体质量140～180 g（军事医学科学院提供），动物置于恒温、恒湿的安静饲养室内分笼饲养，每笼3只，标准饲料喂养。

1.1.2 主要试剂

免疫纯牛Ⅱ型胶原（Chondrex公司）。弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂（Sigma公司）。MTX（澳法玛西亚公司）。A-BOX（本室纯化）经鉴定合格后-20℃储存备甪[9]。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠CIA模型的制备

按本实验室方法制备大鼠CIA模型[9]。将牛Ⅱ型胶原（2 mg/mL）与福氏完全佐剂等体积混匀并乳化，取0.5 mL在大鼠背部、尾根部及足垫多点皮内注射。1周后，将Ⅱ型胶原与弗氏不完全佐剂等体积混匀并乳化，取0.5 mL同上多点注射进行加强免疫。4周后，将大鼠随机分为3组，每组12只，腹腔内分别注射A-BOX（每只大鼠0.62 mg，A-BOX组）、甲氨蝶呤（1 mg/Kg，MTX组）和生理盐水（阴性对照组），每周1次，连续治疗4周。4周后处死所有大鼠，取大鼠右侧踝关节行X线摄片及病理切片观察关节损伤情况。

1.2.2 CIA大鼠模型的评价

关节炎严重程度以平均关节炎指数（Arthritis index，AI）评价[9]，0级：无红肿；1级：局限于足或踝关节的轻度红肿；2级：足趾至踝关节的轻度红肿；3级：足趾至踝关节中度红肿；4级：踝关节至整个腿红肿或关节畸形，活动受限。

1.2.3 病理学评分

所有大鼠取踝关节，经固定、脱钙、石蜡包埋后连续切片，行HE染色，显微镜下观察组织病理表现，由病理科医生参照以下标准进行关节病理评分：根据炎症细胞浸润、侵蚀性血管翳、滑膜增生程度3项指标，每项按轻重程度评为0～3分（0分：无改变；1分：轻度；2分：中度；3分：重度）。

1.2.4 X线评分

所有大鼠取右后肢，甲醛固定后，对右后踝进行X线摄片（电压60 KV，电流7 mA，曝光0.04 ms）。踝关节骨质破坏程度由专科医师，用Larsen评分标准进行单盲评分。具体标准为[9]：0分为正常；1分为轻度异常，包括一处或多处关节周围软组织肿胀，骨质疏松和轻微关节间隙狭窄；2分为明确的早期异常，包括明显骨质侵蚀改变、有或没有关节间隙狭窄；3分为轻度关节破坏伴关节间隙狭窄程度小于正常的50%；4分为重度关节破坏，关节间隙狭窄程度大于正常的50%，但未消失；5分为多个关节残毁，关节间隙消失。

1.2.5 统计学分析

数据以均数±标准差表示，采用Excel 2010和SPSS 17.0医学统计软件进行统计学处理，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 关节炎症状评分

实验第3周，大鼠踝关节肿胀程度均达高峰，之后肿胀趋于稳定或略有降低，在第4周时均已稳定。模型动物关节炎评分为7.25±0.70，显著高于正常大鼠（0.00±0.00）（P＜0.01）。治疗4周后，阴性对照组症状评分为（7.77±0.44），显著高于MTX组（6.25± 1.03）（P＜0.05）和A-BOX组（6.12±0.99）（P＜0.01）。MTX组与A-BOX组无显著差异（P＞0.05）（图1）。

图1 各组大鼠后肢大体观。Fig.1Representative hind abnormality of the rats in different groups

2.2 病理学分析及评分

踝关节HE染色观察显示，健康大鼠滑膜无增生，无血管翳形成，未见炎性细胞浸润，关节表面光滑无破坏。阴性对照组和MTX组踝关节均可见滑膜层增生、新生血管形成、炎细胞浸润、软骨和骨破坏，而A-BOX组未见滑膜增生但可见新生血管形成和炎细胞浸润（图2）。

图2 治疗4周后大鼠踝关节病理观察Fig.2Representative histological observation of rat ankle joints 4 weeks after treatment

病理切片评分发现，所有健康大鼠滑膜和关节评分均为0级，A-BOX组滑膜增生、血管新生和炎症评分为（0.00±0.00），（1.14±0.69）和（1.71±0.75）；MTX组为（0.71±0.48），（1.57±0.78）和（1.42±0.53），均显著低于阴性对照组（2.28±0.45），（1.85±0.69）和（2.14±0.89）（P＜0.05）。A-BOX组未见滑膜增生，评分低于MTX组（P＜0.05）；两组间其他改变无明显差异（P＞0.05）。结果提示，A-BOX对CIA的治疗作用略优于MTX。

2.3 大鼠踝关节X线的分析

踝关节X线片单盲评分，A-BOX组、MTX组和阴性对照组分别为（1.85±1.06），（2.14±0.37）和（3.28±0.48），组间差异显著（P＜0.05）。提示，A-BOX对大鼠CIA的治疗作用优于MTX（图3）。

图3 各组踝关节X线改变Fig.3Typical X-ray films of rats ankles in each group

3 讨论

类风湿关节炎是一种慢性全身反应性的自身免疫性疾病，目前尚无特效治疗药物，甲氨喋呤（MTX）做为RA的一线治疗药，可以有效减轻类风湿关节炎的炎症症状，并且可以预防或减少骨质的侵蚀和破坏，但因副作用明显而限制了其临床使用。我们的既往研究表明，A-BOX单体与HMGB1类似，具有抗炎性反应和促成骨分化作用的双重性，为类风湿关节炎的治疗提供了新的方向。

有研究表明[10]，HMGB1蛋白是一种晚期促炎因子，胞外的HMGB1可以促进成血管细胞的迁移和增殖。在RA患者和CIA模型动物的滑膜组织中，HMGB1的表达均明显增强，血清中HMGB1明显增多，且巨噬细胞分泌促炎因子，如TNF-a和IL-1的水平明显增高。为探讨A-BOX对类风湿性关节炎治疗的作用，本实验以CIA大鼠模型为研究对象，与常用药物MTX比较，观察A-BOX的治疗效果。实验结果表明，CIA大鼠腹腔注射A-BOX拮抗HMGB1蛋白表达，可以减轻大鼠的骨质破坏和滑膜增生，且病理和X线检查结果均优于MTX的疗效。

A-BOX拮抗HMGB1蛋白的具体机制尚未明确，但根据本实验结果，我们推测，A-BOX进入大鼠体内与HMGB1受体结合，抑制巨噬细胞分泌TNF-a和IL-1等促炎因子分泌，减轻炎症刺激，抑制成血管细胞的迁移和增殖，进而达到减轻滑膜增生的效果。另外，利用A-BOX单体治疗，可以通过加强关节腔内间充质干细胞的促成骨作用，加速骨组织损伤的修复，以达到治疗RA的目的。

本实验为类风湿关节炎的治疗提供了一个全新的方向，但是仍有许多问题亟待解决，如临床单用重组纯化的A-BOX治疗RA能否取得令人满意的效果？异体来源纯化的A-BOX应用于人体内是否会产生副作用？怎样才能实现体内有效给药？而关于A-BOX拮抗HMGB1蛋白的具体机制亦仍需大量研究来深入明确地进行阐述。

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Therapeutic Effect of A-BOX Domain of High Mobility Group-1 on Rat Arthritis Induced by Collagen

CAO

Xiaofang1*,BI Xiaoyun2*,WANG Yongqi1,LI Zhiyong3,CHEN Jingli2,HUANG Shu2,GUO Zikuan3,WANG Hengxiang1.1 Department of Hematology,General Hospital of Air Forces,Beijing 100036,China;2 Department of Biological Diagnosis and Therapy,Guangzhou Hospital of Developmental District,Guangzhou 510730,China;3 Department of Experimental Hematology,BeijingInstituteofRadiation,Beijing100850,China.Correspondingauthor:WANGHengxiang (wanghengxiang123@yahoo.com.cn).*These authors contributed equally to this work.

ObjectiveTo investigate if A-box domain of human high mobility group protein-1(A-BOX)could exhibit beneficial effects on rheumatoid arthritis.MethodsRat arthritis model was developed by four-week injection of collagen (collagen-induced arthritis,CIA),followed by scoring on arthritis symptoms and dividing at random into three groups that received peritoneal injection of A-BOX at a dose of 0.62 mg per rat(A-BOX group,n=12),methotrexate(MTX group,n=12) at a dose of 1 mg/Kg or saline(control group,n=12)respectively.Each group contained 12 rats and the injections were performed weekly for four consecutive weeks.Scoring of symptoms and pathological and X-ray examinations on the ankle knees were performed after treatment.ResultsThe results showed that arthritis symptoms occurred in all the tested rats andthe scoring(7.25±0.70)was significantly higher than that of healthy controls(0.00±0.00,P＜0.01).After four-week therapy, the symptom scores in control group were 7.77±0.44,greatly higher than those in MTX group(6.25±1.03,P＜0.05)and ABOX group(6.12±0.99,P＜0.01).Meanwhile,there was no difference between MTX group and A-BOX group(P＞0.05). Pathological examination revealed that the scores of synovial hyperplasia,new blood vessel formation and inflammation in ABOX group were 0.00±0.00,1.14±0.69 and 1.71±0.75 respectively,and those in MTX group were 0.71±0.48,1.57±0.78 and 1.42±0.53,all the parameters of which were significantly lower than those in control group(2.28±0.45,1.85±0.69,2.14±0.89, P＜0.05).Furthermore,the scoring of synovial hyperplasia in A-BOX group was lower than that in MTX group(P＜0.05),while there were little difference on the other two parameters between these two groups(P＞0.05).Scoring on X-ray results showed that rats in A-BOX group(1.85±1.06)restored better than rats in MTX group(2.14±0.37),which was lower than that of control group(3.28±0.48).ConclusionA-BOX could exhibit more beneficial effect on CIA rat than MTX,enhancing the possibility of its application in clinical trials.

A-box of high mobility group protein-1;Methotrexate;Collagen-induced arthritis

R593.22

A

1673－0364（2013）03－0137－04

2013年4月23日；

2013年5月15日）

国家自然科学基金（30971068）；国家863课题（2011AA020101）；广州开发区科技局课题（2009Q-P081，2010QP035）。

100036北京市中国人民解放军空军总医院血液科（曹小芳，王勇奇，王恒湘）；510730广东省广州市广州市经济技术开发区医院（毕晓云，黄舒，陈晶励）；100850北京市军事医学科学院放射与辐射医学研究所实验血液学研究室（李志勇，郭子宽）。

王恒湘（Email：wanghengxiang123@yahoo.com.cn）。

注：曹小芳、毕晓云为共同第一作者。

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.03.005