许阳光，张金玲，刘 亮，李学锋*

(1.中国农业大学 理学院，北京 100094;2.农业部农药检定所，北京 100024)

喹禾灵(quizalofop－p－ethyl)化学名称2 －［4 －(6 －氯－2 －喹恶啉氧基)苯氧基］丙酸乙酯，是20世纪80 年代开发的一种芳氧苯氧丙酸类除草剂，为选择性内吸传导型除草剂，喹禾灵在植物组织和土壤微生物的作用下快速水解成相应的酸，可以有效抑制目标杂草叶绿体内的乙酰辅酶A 羧化酶，是一种较理想的茎叶处理剂。喹禾灵含有一个手性碳原子，有一对光学异构体，其中只有R 体有除草活性，S 体是不具有除草活性。大多数情况，喹禾灵都以R 体的形式(精喹禾灵)生产并应用，精喹禾灵含量及R－对映体与S－对映体的比值，是衡量其原药及制剂产品质量的最主要指标。

长期以来，人类在研究手性农药的环境行为及生态效应时，常常将含有两种或两种以上对映体的外消旋体农药当作一种农药来处理，这样往往不能真实地反映其对环境可能造成的危害和对人类健康的潜在影响。这就迫使我们必须进行手性农药对映体的选择性环境安全评价研究，重新考虑其对环境和人类健康所可能造成的影响，为环境治理和研发高效、低毒、低残留的新型农药提供依据。此外，对映体空间结构上的细微差别即可引起毒性效应的显著不同，这就为化合物毒理机制的研究提供了参考。因此，在对映体水平上研究手性农药的环境行为和生态效应，具有十分重要的理论价值和实际意义。

有研究发现部分手性农药对水生生物的急性毒性存在显著的对映体选择性［1，2］。如联苯菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯、氟虫腈、丙草胺及甲霜灵等手性农药［3］。在大型溞和网纹水溞的急性毒性与拟除虫菊酯类农药的对映体选择性相关研究中，针对cis－BF 而言，只有1R－cis－BF 表现出对网纹水溞的急性毒性;在氰戊菊酯对大型溞的急性毒性试验中，αS －2S － FV 的急性毒性显著高于 αR －2R － FV［4］;在氯菊酯中，1R－顺式体和1R－反式体表现出相对显著的农药活性［5］。在研究噻唑磷(thiazoline)的外消旋体及其对映异构体对大型溞的水生急性毒性效应试验中发现，其不同对映异构体对大型溞的LC50值存在显著差异，其中外消旋体在24 h 暴露试验中相对于其他对映异构体显示出了较低的毒性效应［6］。在此基础上，国内外近年来先后建立了多种体内、外研究模型，对手性农药多种毒理学效应的对映体选择性及其分子机理进行了一系列研究［7，8］。针对手性农药对水生标志生物的对映体选择性毒性进行了探讨［9］。2007 年 Wang 等［10－11］对联苯菊酯的研究发现，其 cis－BF 对大型溞的慢性毒性试验结果表现出对映体选择性:即1R－cis－BF 的慢性毒性远远高于1S－cis －BF，在7 d 及14 d 的慢性暴露试验中，1S－cis－BF 对大型溞的存活率及繁殖力的最小有效浓度(MED)分别为1R －cis －BF 的40 和80 倍，且大型溞对 1R － cis－ BF 的生物累积作用是 1S － cis － BF 的 14 ～ 40 倍，其中 1R － cis － BF 在环境中的代谢速率相对1S－cis－BF 较慢可能是其富集浓度差异的原因之一［12］;2005 年Liu 等［13］发现氟虫腈对网纹水溞的毒性也存在对映体选择性，其(+)－氟虫腈及其外消旋体对网纹水蚤的慢性毒性显著高于(－)－氟虫腈。

喹禾灵在对映体水平的毒理数据并不充分，对水生生物手性选择性毒性研究和环境安全评价研究尚未见报道。本文选用大型溞进行试验，研究喹禾灵及精喹禾灵对大型溞的急性毒性，以及对大型溞进行慢性毒性试验，观察大型溞相关的生物学参数(如存活率、生长速度、产卵量以及有关的生化指标)的变化区别。目的在于探讨喹禾灵在对映体水平上对水生生物毒性的手性选择性，为准确、全面地进行农药环境安全评价提供科学依据，为农药对映体的筛选和安全性评价提供准确合理的依据。

1 材料与方法

1.1 试验药剂

精喹禾灵(quizalofop－P)95%原药和喹禾灵(quizalofop －ethyl)90%原药，均由江山农药有限公司提供;其他试剂均为分析级或生物级试剂。

1.2 试验生物

大型溞(Daphnia magna straus)系从农业部农药检定所生测中心引种的62 D.M 纯品系生物株，在试验室培养3 代以上。饲养密度为每50 mL 培养液1 只母溞。一星期更换2 ～3 次培养液。每天喂食斜生栅藻(Scemedesmus subspicatus)。投饵密度为每 l mL 含 2.0 ×105～3.0 ×105个藻类细胞。试验前挑选出生6 ～24 h 的健康活泼的幼溞用于毒性试验［14］。

1.3 试验方法

1.3.1 大型溞48 h 急性毒性试验 参考OECD(1984)标准试验方法［15］进行。设置5 个系列试验浓度、一个空白对照组和一个最大助剂浓度对照组，每个浓度4 个平行组，每个烧杯中放10 只个体均匀的6 ～24 h 的幼溞，水温(20 ±2)℃。用曝气水大于24 h 的稀释水配制成不同浓度的试验溶液(pH 7.5 ±0.5)，保持光照与黑暗比16∶ 8，试验期间不投放饵料，不更换试验溶液，48 h 后观察大型溞存活状况并记录试验结果。

1.3.2 大型溞21 d 慢性毒性试验 慢性毒性试验参考OECD 标准方法［15］，试验浓度设置以急性48 h－EC50和预试验结果为基础，设置一个空白对照组和一个助剂最大浓度对照组，以及5 个浓度水平。精喹禾灵和喹禾灵浓度依次为 0.062 5，0.125，0.25，0.50 mg/L;每个浓度 10 个平行组。试验溶液用曝气24 h 以上的稀释水配制，每个烧杯中盛放40 mL 试验溶液，每个烧杯中放2 只6 ～24 h 的幼蚤。试验期间采用半静态试验系统，用新鲜的栅藻(2.0 ×105～3.0 ×105mL－1)喂养大型溞。每隔一天更换1 次试验溶液，保证试验期间药剂浓度为起始浓度的80%以上。

试验期间每24 h 观察1 次，取出新生幼溞，纪录母溞第一次产卵时间、第一次产卵数、第三次产卵时间、第三次产卵数以及整个试验过程中的产卵次数、总产卵数、母溞脱皮次数等，试验结束时在显微镜下测量其体长(从头盔至壳刺部的长度)。

1.3.3 数据处理 用统计软件SPSS12.0 计算急性毒性试验的LC50的值和95%置信限。酶活性测定结果用SPSS 16.0 软件进行统计分析，并用平均值±标准误差表示，各浓度组酶活性数据与空白组的比较采用 AVONA － Dunnent 检验;P ＜0.05 认为存在显著差异(*)，P ＜0.01 存在极显著差异(＊＊)。大型溞慢性毒性试验所有数据均以平均值±标准差(SD)表示，并采用变异分析(ANOVA)和Duncan 检验法统计分析，用SPSS12.0 软件进行显著性分析，P ＜0.05，比较对照组和药剂处理组之间的区别。

2 试验结果

2.1 喹禾灵和喹禾灵对大型溞的48 h 急性毒性

从表1 可以看出，喹禾灵和精喹禾灵对大型溞的48 h 急性毒性均为中等毒。

表1 喹禾灵和精喹禾灵对大型溞的急性毒性Tab.1 The acute toxicity of difenoconazle to Quizalofop-ethyl and Quizalofop-P

2.2 精喹禾灵和喹禾灵对大型溞的21 d 慢性毒性试验结果

精喹禾灵(亚致死剂量)对大型溞F0代母溞的存活、生长以及繁殖等影响情况见表2 和表3。试验中所用的指标均为亚致死浓度农药对大型溞产生影响的毒性指标。

在整个试验周期内，对照组(包括空白和丙酮)均未发现冬卵现象，但是喹禾灵在高浓度0.50 mg/L 时出现雄溞，如图1(右)，且部分蜕皮出现异常，即蜕不完整，如图2。母溞产第一胎后，在显微镜下观察幼溞，未发现异常，如图3。由表2 和3 可知，精喹禾灵和喹禾灵对大型溞的产卵时间、产卵数以及母溞脱皮次数、体长均有不同程度的影响，现将结果分析如下:(1)经药剂处理后，大型溞的脱皮次数明显减少，在浓度低于0.125 mg/L 时，两种药剂对大型溞脱皮的影响基本一致，但当浓度高于0.25 mg/L 时，精喹禾灵对大型溞脱皮影响更为明显;(2)然而，精喹禾灵和喹禾灵对大型溞产卵时间和产卵数的影响恰恰与对脱皮影响相反，经精喹禾灵和喹禾灵处理后，产卵时间均明显延后，产卵数也明显受到抑制，精喹禾灵浓度在0.062 5 mg/L 以上时第一次产卵时间明显延后，并且当浓度达到0.25 mg/L 时，大型溞的产卵数明显受抑制;浓度在0.25 mg/L 时产卵总量和母溞产卵胎数较对照组(包括空白组和丙酮组)明显减少;喹禾灵药剂处理组第一次产卵时间与对照组相比差异显著，并且浓度越高，差异越显著;当浓度大于0.25 mg/L 时，第三次产卵时间明显延后，产生后代幼溞的个数和胎数随浓度升高也明显减少;浓度高于0.25 mg/L 时，喹禾灵对大型溞产卵时间的延后以及产卵数的抑制作用较精喹禾灵更为明显。(3)此外，精喹禾灵和喹禾灵对大型溞的体长也具有一定的影响，药剂处理组大型溞母溞的体长与对照组相比差异显著，但两种药剂之间的差异不大，不同浓度的处理组之间差异也不明显。

表2 不同浓度的精喹禾灵作用下F0 代大型溞生长和繁殖指标的变化Tab.2 Growth and fecundity of F0 generation of D.magna exposed to Quizalofop-P in 14 -day life study

图1 大型溞雌溞(左)和雄溞(右)Fig.1 Male (left)and female (right)D.magna

图2 大型溞蜕皮异常，蜕不完整Fig.2 The D.magna that the exuvia in abnormal

图3 大型溞正常成熟个体(已怀卵)Fig.3 The normal mature D.magna (the breeding one)

3 讨论与结论

精喹禾灵和喹禾灵对大型溞均为中毒，精喹禾灵毒性高于喹禾灵。可见精喹禾灵对于水生生物的毒性高于喹禾灵。

喹禾灵与精喹禾灵对大型溞21 d 慢性毒性试验，对照组(包括空白和丙酮)均未发现冬卵现象，但是喹禾灵在高浓度0.50 mg/L 时出现的雄溞，母溞产第一胎后，在显微镜下观察幼溞，未发现异常;精喹禾灵和喹禾灵对大型溞的产卵时间、产卵数以及母溞脱皮次数均有不同程度的影响，且二者在脱皮次数、产卵时间和产卵数等方面有显著差异，对于大型溞体长差异不大、不同浓度的处理组之间差异不明显。经精喹禾灵和喹禾灵处理后，产卵时间均明显延后，产卵数也明显受到抑制，精喹禾灵浓度在0.062 5 mg/L 以上时第一次产卵时间明显延后，并且当浓度达到0.25 mg/L 时，大型溞的产卵数明显受抑制;喹禾灵药剂处理组第一次产卵时间与对照组相比差异显著，并且浓度越高，差异越显著;当浓度大于0.25 mg/L 时，第三次产卵时间明显延后，产生后代幼溞的个数和胎数随浓度升高也明显减少;由此可见，大型溞的生物学参数之间是相互影响相互关联的。精喹禾灵和喹禾灵不同程度的影响了母代大型溞的蜕皮、繁殖等生物学指标，处理组大型溞产生后代的总数明显低于对照组，由此可见化学品通过影响个体的生存和繁殖抑制了水溞种群动力学。结果表明，手性农药的水生慢性毒性对映体选择性可能与水生生物的选择性吸收等生理过程有关［16］。

研究发现，精喹禾灵和喹禾灵对大型溞的产卵量及卵的孵化有明显的影响，随着浓度的升高，时间的延长，影响也随之变明显，二者影响程度不同。尤其是对卵的孵化的影响，由于试验开始是未预测到该项指标，没有将该指标纳入观测指标之列，加之卵出现的时间短，个体小，没有引起足够重视，以至于开始时没有记录开始出现的未孵化卵的个数，但可以明显观察到随着浓度的升高和时间的延长，卵的数量明显减少，对此可以做进一步研究。

喹禾灵和精喹禾灵对大型溞的慢性毒性试验结果也表现出对映体选择性。喹禾灵和精喹禾灵对大型溞毒性效应差异的机理还需深入研究，尤其是通过分子毒理学的方法寻找导致效应差异的目标分子。

［1］Overmyer J P，Rouse D R，Avants J k，etal.Toxicity of fipronil and its enantiomers to marine and freshwater non － targets［J］.J Environ Sci Health，2007，42(5):471 －480.

［2］Konwick B J，Fisk A T，Garrison A W，et al.Acute enantioselective toxicity of fipronil and its desulfinyl photoproduct to Ceriodaphnia dubia［J］.Environ Toxicol Chem，2005，24(9):2350 －2355.

［3］Liu W P，Gan J Y，Shneak D，et al.Enantioselectivity in environmental safety of current chiral insecticides［J］.Proc Natl Acad Sci USA(PNAS)，2005，102(3):701 －706.

［4］Ma Y，Chen L A，Lu X T，et al.Enantioselectivity in aquatic toxicity of synthetic pyrethroid insecticide fenvalerate［J］.Ecotoxicol Environ Saf，2009，72(7):1913 －1918.

［5］Liu W P，Gan J Y，LeeS J，et al.Isomer selectivity in aquatic toxicity and biodegradation of bifenthrin and permethrin［J］.Environ Toxicol Chem，2005，24(8):1861 －1866.

［6］Lin K D，Zhang F，Zhou S S，et al.Stereoisomeric separation and toxicity of the nematicide fosthiazate［J］.Environ Toxicol Chem，2007，26(11):2339 －2344.

［7］Nillos M G，Rodriguez－ fuentes G，Gan J，et al.Enantioselective acetylcholinesterase inhibition of the organophosphorous insecticides profenofos，fonofos，and crotoxyphos［J］.Environ Toxicol Chem，2007，26(9):1949 －1954.

［8］Miyashita M，Shimada T，Nakagami S，et al.Enantioselective recognition of mono － demethylated methoxychlor metabolites by the estrogen receptor［J］.Chemosphere，2004，54(8):1273 －1276.

［9］Liu W P，Gan J Y，Shneak D，et al.Enantioselectivity in environmental safety of current chiral insecticides［J］.Proc Natl Acad Sci USA(PNAS)，2005，102(3):701 －706.

［10］Wang L M，Liu W P，Yang C X，et al.Enantioselectivity in estrogenic potential and uptake of bifenthrin［J］.Environ Sci Technol，2007，31(18):6124 －6128.

［11］Zhao M R，Wang C，Liu K K，et al.Enantioselectivity in chronic toxicology and uptake of the synthetic pyrethroid insecticide bifenthrin in Daphnia magna［J］.Environ Toxicol Chem，2009，28(7):1475 －1479.

［12］Aaron W，Brad J，Arthur W，et al.Enantioselective chronic toxicity of fipronil to Ceriodaphnia dubia［J］.Arch Environ Contam Toxicol，2008，54:36 － 43

［13］Liu W P，Gan J Y，Lee S，et al.Isomer selectivity in aquatic toxicity and biodegradation of bifenthrin and permethrin［J］.Environ Toxicol Chem，2005，24(8):1861 －1866.

［14］Zhou Yong xin，Zhang Zong she.Aquatic toxicity test［M］.Beijing:China Agriculture Press，1989.

［15］国家环保局.化学农药环境安全评价试验准则［J］.农药科学与管理，1990(2):1 －5.

［16］唐梦龄，王丹，傅柳松，等.手性农药毒性机制的对映体选择性［J］.农药学学报，2011，13(4):335 －340.