赵 强，王一洲

膝骨性关节炎（KOA）是一种常见的慢性关节疾病，本病多见于中老年人，是影响中老年人生存质量的重要因素。膝关节是负重关节，关节表面覆盖有关节软骨，这层软骨组织是运动系统的重要组成部分，能降低关节面的摩擦系数,分散关节面的压力负荷[1]。随着KOA的病程发展，软骨细胞的损伤也随之加重。研究软骨细胞的变化是探索KOA的病因病机和治疗方法的重要途径。笔者检索并分析了近十年国内外软骨细胞的培养和其影响因素的相关文献，为KOA的深入研究提供证据。

1 KOA模型的建立

KOA模型的制作方法分为两类，即诱发模型，如手术、关节制动等，以及自发模型，如STR/ORT小鼠、老年拉布拉多犬等，其主要目的就是为了模拟骨性关节炎发病和进展的过程，通过动物实验观察软骨凋亡的诱因以及细胞代谢在分子水平的变化。

1.1 手术造模

1.1.1 Hulth造模法及改良造模法 Hulth造模法是最经典的KOA造模方法之一，具体操作为[2]：无菌条件下，通过吸入2%Halotane麻醉，下肢伸直位于膝关节内侧纵切长约2 cm手术窗口显露膝关节，屈曲膝关节，向外侧推开髌骨，保护微血管及脂肪垫，然后切断前后交叉韧带,完整切除内侧半月板,保留关节软骨面，逐层缝合。术后4 d给予口服镇痛药，适当给予抗生素预防感染，4 d后不固定伤肢，自由活动。14周后将形成较明显KOA模型。刘献祥等[3]对Hulth造模方法进行改良：取兔膝关节内侧入路，切断内侧副韧带，摘除内侧半月板，切断前交叉韧带。术后连续3 d青霉素20万U肌肉注射，1周后开始每天强迫兔活动0.5 h，连续16周后，模型组关节液内白细胞介素（IL）-1、IL-6等炎症因子的表达明显升高，且膝关节的稳定性较好。

1.1.2 关节刻痕造模法 Marijnissen等[4]通过在狗膝关节股骨髁上刻痕，不损伤软骨下骨，术后将对侧肢体固定于躯体上，迫使手术肢体负重，每周3 d，每天4 h，共20周。40周（后20周正常负重）后，关节软骨在组织和生化方面已形成明显的骨性关节炎（OA）特点，且应用此法复制的KOA模型具有关节稳定性好、炎症反应轻的优点，适用于轻度或早期KOA研究的应用。李钊等[5]对关节刻痕法进行改进，手术时定位股骨髁、髌骨及髌韧带后。紧靠髌韧带两侧髌骨下方对准股骨髁方向进针,用小针刀在股骨髁软骨面上刻痕,每侧刻痕4~5道,然后调整方向分别在髌软骨及胫骨平台上刻痕，尽量不伤及半月板，每道刻痕深度不超过软骨全层，手术后第2天即开始每日强迫驱赶动物活动30min，驱赶动物活动至5周时,即得明显的骨性关节炎模型。此法可以最大限度的减少手术后的炎症干扰，但由于手术精度较差不能避免一些操作失误引起的误差。

1.1.3 关节失稳造模法 朱鸿飞等[6]将16只健康纯种成年新西兰大白兔随机分为正常组、模型4周组、模型6周组和模型8周组，每组4只。各模型组实验兔于无菌条件下造成双后肢膝内侧髌韧带2/3缺损，术后允许其自由活动，手术7 d后每天强迫活动1 h。结果发现模型6周组表现为膝骨性关节炎早期改变，模型8周组表现为膝骨性关节炎中期改变。髌韧带内侧缺损法构建兔膝骨性关节炎模型，能更好地再现因应力异常而导致的膝骨性关节炎。Liu等[7]通过对犬膝关节外侧施加68 N和90 N的直接外力，导致其膝关节内侧副韧带损伤，形成膝关节不同程度失稳的模型，通过有限元模拟力—位移的程度，建立膝关节失稳的不同等级，量化KOA早期应力失常的程度和其影响。王胜等[8]用手术方法延长兔髌韧带3 mm，降低髌股关节压力，术后6周开始出现软骨细胞增生、排列紊乱，16周时软骨已明显变薄，并且出现纵裂纹和胶原纤维增粗、断裂。

1.2 关节注射造模 关节软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨三者合成与降解过程失衡的结果[9]。孙鲁宁等[10]运用木瓜蛋白酶诱导兔膝骨性关节炎，检测注射后第2、4、6周3个时间点相应组实验动物的膝关节滑膜IL-1，IL-6、白三烯的浓度，并与正常侧对比，结果发现膝关节首次注射木瓜蛋白酶后4周内炎症因子水平变化显著（P<0.05）。邓宇等[11]分别以1.6%木瓜蛋白酶或Ⅱ型胶原蛋白酶溶液注入兔膝关节，并测试不同浓度的两种蛋白酶对骨性关节炎的诱导作用，结果发现低剂量的胶原蛋白酶可较稍高剂量的木瓜蛋白酶诱导出更为严重的软骨退变。关节腔内注射化学物建模所需时间短，可模拟软骨破坏的终末环节，适于软骨病理、药物防治的研究，尤其是对KOA炎症反应有较好作用的干预手段。

1.3 自发模型 Hyttinen等[12]通过在纯合形式中Col2a1基因的灭活会阻止软骨内骨形成，导致小鼠软骨基质中Ⅱ型胶原纤维的缺失，观察发现小鼠关节软骨及软骨下骨胶原网状结构的变化，证明Col2a1等位基因的失活很可能导致被观察的关节软骨软化和小鼠骨性关节炎的高患病率。Simkin等[13]通过观察不同年龄组的犬类关节腔的静水压和渗透压发现，犬类的年龄与关节液的胶渗透压正相关。李昊[14]观察不同年龄兔软骨细胞形态发现成年软骨细胞直径大于幼年软骨细胞直径，小于老年软骨细胞直径（P＜0．01）。

2 KOA软骨细胞培养

2.1 软骨细胞分离 高效分离纯净的KOA软骨细胞是KOA基础研究的第一步，在软骨组织工程研究中对种子细胞的数量要求巨大、生物学功能活性要求高，细胞的来源仍是未很好解决的问题。1967年Manning和Bonner[15]首次把胰蛋白酶和胶原酶结合使用来消化关节软骨，把软骨细胞从坚韧的软骨基质中分离出来，周强等[16]用三步酶消化法分离培养软骨细胞，以1 g/L胰蛋白酶和1 g/L乙二铵四乙酸（EDTA）混合液、1 g/L透明质酸酶和2 g/LⅠ型胶原酶顺序消化关节软骨分离细胞，并检测细胞收获效率和存活率，关节软骨经三步酶消化基质逐步解离和降解,细胞得以完全释放和分离,每克软骨的细胞收获量平均为50.13×106个细胞,细胞存活率平均为98.18%。李保林等[17]在剪碎的软骨中加入0.2%Ⅱ型胶原酶5mL，过滤、离心8min，弃上清，加入5mL含有血清的DMEM培养液混匀以终止消化,再离心5min,弃去上清液,只留下细胞球,并加入少量含有血清的培养液吸打后先封口置放。原消化瓶中再加入0.2%Ⅱ型胶原酶5mL,如前法消化45min，消化后的处理同上，取得活细胞率约90%左右。周国顺等[18]用酶消化法分离兔关节软骨细胞，高密度单层培养并传代，当单层细胞铺满培养瓶底时用0.25%的胰酶加0.02%的EDTA消化，2∶3传代，较好的获取大量优良软骨细胞。

2.2 软骨细胞培养的调控因素

2.2.1 应力刺激 生物力学因素在骨性关节炎的发病中起重要作用，适度的力学载荷作用于软骨细胞,可以促进成骨细胞增殖,在载荷作用下,细胞要经历复杂的信号转换和传递的过程。研究已证明许多细胞表面的离子通道在细胞膜受到机械作用数秒或数分钟后可引起G蛋白活化、第二信使释放、蛋白质磷酸化、生长因子的分泌、细胞骨架的变化、细胞和细胞外基质黏附的重建、基因表达的改变等[19]。Alexopoulos等[20]用酶解的方法分离出较多的Chondron，经过研究发现Chondron包含有较多的蛋白多糖和Ⅱ、Ⅵ、Ⅸ型胶原，其中Ⅵ型胶原为特有的胶原，对力学信号的传导有重要的作用。Labelle等[21]发现钙离子含量变化介导的软骨细胞增殖主要通过激活瞬时受体电位途径来实现。Vinardell等[22]对猪膝关节软骨细胞加载10MPa静态压力并采用转化生长因子-β（TGF-β）进行培养，结果检测到Sox9基因表达较未添加TGF-β培养组增强3倍，糖胺聚糖（GAG）合成也明显增多，提示应力可使细胞表型及相关基质成分发生重要变化。

2.2.2 细胞因子 Ray等[23]证明活化蛋白-1（AP-1）和血清淀粉样蛋白A激活因子-1（SAF-1）具有协同作用，可作为共活化物介导基质金属蛋白酶-9（M M P-9）基因的转录激活，易致炎性的c-Jun转录蛋白可促进犬MMPe-1基因的表达,从而加速关节软骨基质降解。童徐等[24]观察炎性细胞因子IL-1β作用于SD大鼠髁突软骨细胞后，细胞内源性生长因子TGF-β表达的改变，发现软骨细胞在IL-1β作用下，TGF-β表达增加。田峰等[25]发现病态软骨中 TGF-β1、IL-1β1 的表达比正常软骨高（P＜0．05）。

3 展望

KOA是临床常见病、多发病，KOA模型的建立及软骨细胞生理特性的的深入研究是探讨骨性关节炎发病机制的重要步骤。由宏观向微观深入、宏观与微观相结合是骨性关节炎基础研究的基本趋势。国内对于软骨细胞各种生物特性的研究才刚刚起步，在实验设计及操作方案上大多参照国外同类实验，开发和生产更适用于国内技术平台和研究需要的动物模型及软骨细胞，尤其是利于中医、中药应用的实验材料，是目前亟待解决的问题。希望能通过多途径、多靶点的研究证实临床效果显著的中医药治疗方法，将中国传统医学发扬光大。

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