蔡尤佳，刘晓兰，郑喜群

（齐齐哈尔大学食品与生物工程学院黑龙江省高校农产品加工重点实验室，黑龙江齐齐哈尔161006）

据调查，血栓引起的心脑血管疾病正日益严重地危害人们的健康，已成为人类主要杀手之一。目前临床应用的治疗血栓性疾病的溶栓剂主要有尿激酶、链激酶、组织型纤溶酶原激活物等。但它们都存在着不同程度的不足，如半衰期短、抗原性强、副作用较大、价格昂贵等，很难成为大众药品。自日本学者须见洋行等[1]从日本传统食品纳豆中提取出具有纤溶活性的纳豆激酶以来，从微生物发酵膳食中寻找和开发抗栓及溶栓性保健食品已受到各国科学家的普遍重视[2]，如从韩国传统食品Chungbook-Jang 和Doen-Jang 中提取的纤溶酶CK 和Subtilisin DJ-4[3-4]，从中国大豆食品豆豉中分离到的豆豉纤溶酶[5]，以及从蛹虫草液体发酵物中提取得到的真菌纤溶酶[6]等。这些从食源性食品中发酵得到的具有纤溶活性的酶，可催化血纤维蛋白水解，溶解血栓骨架蛋白，使血栓溶解[7]。将食源性食品中得到的纤溶酶，开发成口服性保健食品，不仅可以预防心脑血管疾病的生成，安全性能好，易于吸收，而且成本较低，这些优点对预防血栓疾病的保健食品的研究和开发具有重大的推动作用。

本实验室以小米粉培养基为基础发酵培养基，采用液体深层发酵方法培养嗜酸放线菌701，经检验上层发酵液具有较强的纤溶活性。嗜酸放线菌（Acidophilic actinomycetes）为放线菌（Actinomycetes）中的链霉菌属，为非致病菌，广泛分布于酸性环境中，尤其是土壤中[8-9]。它们产生耐酸的胞外酶，如几丁质酶、淀粉酶、蛋白酶等[10]。本研究首先采用单因子实验对放线菌701 发酵产纤溶酶所需的碳源、氮源及金属离子等因素进行筛选，运用Plackett-Burman 设计试验和Box-Behnken 响应面分析法通过最少的试验次数和数学建模得到准确有效的实验设计方法，研究因子与响应值之间，因子与因子之间的交互影响规律，预测最佳点，以达到提高酶活力的目的，为开发新的预防血栓栓塞性保健食品及扩大化工艺研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌种

嗜酸放线菌701（Acidophilic actinomycetes 701），由齐齐哈尔大学微生物遗传实验室选育并保存。

1.1.2 仪器

Sartorius 酸度计：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；新型大容量恒温培养振荡器：上海新蕊自动化设备有限公司；himac CF15RX 型高速冷冻离心机：美国；镀铬游标卡尺：沈阳市第四量具厂。

1.2 培养基

斜面培养基为GYM 固体培养基（g/mL）：葡萄糖0.4%，酵母膏0.4%，麦芽浸膏1%，碳酸钙0.1%～0.2%，琼脂1.8%，pH6.7。

种子培养基为GYM液体培养基（g/mL）：葡萄糖0.4%，酵母膏0.4%，麦芽浸膏1%，碳酸钙0.1%～0.2%，pH6.7。

初始发酵培养基（g/mL）：小米粉1.7%（经粉碎机粉碎，过80 目筛），葡萄糖2%，碳酸钙0.2%，氯化钠0.5%，蛋白胨0.6%，pH4。

1.3 培养方法及粗酶液的制备

斜面培养方法：采用划线法将放线菌接入GYM 固体斜面培养基中，放置于28℃培养箱中避光培养4 d～7d。

种子培养：将活化后的菌种接种到50 mL（250 mL三角瓶）种子培养基中，在温度28℃，摇床转速180 r/min 下培养30 h。

发酵培养：按5%（体积分数）的接种量将上述种子液接入到50 mL（250 mL 三角瓶）发酵培养基中，在温度22 ℃，摇床转速160 r/min 下培养4 d。

粗酶液制备方法：发酵结束后，将发酵液在10 000 r/min、4 ℃条件下，离心10 min，取上清液即为粗酶液。

1.4 分析方法

血纤维蛋白平板法（配制5 个平板）：参照Astrup[11]，略有改动。取0.125 g 琼脂糖加入25 mL 生理盐水中，加热溶解后置45 ℃水浴中保温30 min 后，加入500 U/mL的凝血酶250 μL，混匀。取1 支80 mg/支血纤维蛋白原溶于25 mLHCl-巴比妥钠缓冲液（pH7.8）中，置45 ℃水浴中保温5 min。分别取5 mL 凝血酶溶液与5 mL 血纤维蛋白原溶液混合均匀后，迅速倒入φ9 cm 平皿中，水平静置30 min 后置于冰箱中备用。

放线菌纤溶酶活力测定：用10 μL 发酵液在血纤维蛋白平板上的溶圈面积表示纤溶酶活。取待测酶液10 μL 加样于血纤维蛋白平板上，37 ℃保温6 h，测定溶圈直径，计算面积，纤溶酶活力与溶圈面积正相关。

2 结果与讨论

2.1 培养基中营养成分和培养条件对产酶的影响

本研究以本课题组前期通过单因素实验优化确定的碳源（2%葡萄糖）、摇床转速（160 r/min）、接种量（5%）、培养温度（22 ℃）为基础[12]，对嗜酸放线菌701深层培养产纤溶酶发酵条件进行进一步优化。

2.1.1 小米粉浓度对纤溶酶活力的影响

小米营养丰富，除含有蛋白质、脂肪、糖类以外还含有钙、磷、铁、锌、镁、VA、VE、烟酸等多种营养因子，在发酵过程中提供碳氮源的同时还可以提供丰富的矿物质及生长因子，为放线菌产纤溶酶提供丰富的营养物质。对放线菌产纤溶酶所需的小米粉浓度进行筛选的实验结果见图1。

图1 小米粉浓度对纤溶酶活力的影响Fig.1 Effect of millet concentration on the fibrinolytic enzyme activity

如图1 所示，小米粉浓度为1%时放线菌产纤溶酶活力最大，达到129.43 mm2/10 μL。通过实验得知，当小米粉浓度较低时，纤溶酶活力较低，可能是由于反应体系中的营养物质不够充足，不能满足放线菌产纤溶酶的需求。当小米粉浓度过高时，由于小米粉水溶性较差，可能影响了培养基中的溶氧量，在发酵结束后小米粉没有完全被消耗利用，影响纤溶酶的生成。

2.1.2 氮源对纤溶酶活力的影响

氮源主要是提供合成原生质和细胞其它结构的氮素来源，是影响微生物产酶的重要因素。不同类型的微生物利用的氮源差异较大，选择合适的氮源对微生物的生长及代谢过程有重要的影响[13]。本实验以2 %的葡萄糖，1%的小米粉为初始发酵培养基，分别加入浓度为0.6%的蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸膏、黄豆饼粉、牛肉膏、硝酸钾、硝酸铵和尿素作为氮源，考察不同种类氮源对产酶的影响。

图2 氮源对纤溶酶活力的影响Fig.2 Effect of nitrogen sources on the fibrinolytic enzyme activity

如图2 所示，对放线菌产纤溶酶活力影响较大的依次为牛肉膏、蛋白胨和酵母浸膏，这与Chitte R R 报道的以蛋白胨为氮源产纤溶酶活力比以酵母浸膏为氮源产纤溶酶活力高相一致[14]。其中有机氮中的牛肉膏对放线菌产纤溶酶的影响最大，酶活力最大达到183.92 mm2/10 μL。这可能是由于牛肉膏中含有含氮和非含氮两类物质[15]，其中含氮物包括：肌酸、甘氨酸、黄嘌呤等，非含氮物包括：糖原、生物素、叶酸、无机盐等，这两类物质可以补充蛋白胨营养成分的不足，为放线菌提供氮源的同时还提供能源及生长因子，更好的促进放线菌产纤溶酶。

2.1.3 金属离子对纤溶酶活力的影响

培养基中金属离子的主要功能在于它可以作为酶的组成部分或维持酶的活性，促进菌体生长，调节培养基及发酵液的渗透压、pH 和氧化还原电位等[16]。因此需对培养基中金属离子及其加量进行优化，研究它们对产酶的影响。以2%葡萄糖、0.6%牛肉膏、1%小米粉作为培养基，分别加入0.02 mol/L（经单因素实验优化后确定）CaCO3、NaCl、KCl、MgSO4、FeSO4，以不加金属离子组作为对照，考察不同金属离子对纤溶酶生成的影响，结果见表1。

表1 金属离子对纤溶酶活力的影响Table 1 Effect of metal ions on the fibrinolytic enzyme activity

如表1 所示，CaCO3和NaCl 对放线菌产纤溶酶活性有明显的促进作用。其中CaCO3的添加对产酶有明显的促进作用，可能是因为Ca2+作为蛋白酶的激活剂和稳定剂，同时CaCO3可中和发酵过程中产生的酸，从而控制发酵液pH 的稳定性，保护酶的活性[17]。NaCl 是保持细胞外液渗透压和容量的重要成分，对调节细胞的酸碱平衡具有重要的作用。其它金属离子对产酶均有不同程度的抑制作用。其中铁离子完全抑制纤溶酶的活性，可能是铁离子与酶蛋白的某些特殊基团相结合，引起酶构象的改变，从而导致其生物学功能的丧失。镁离子作为参加酶促反应的重要辅助因子，是许多种酶的激活剂，但在嗜酸放线菌产纤溶酶的代谢过程中，没有起到促进作用，反而抑制了纤溶酶的生成。可能是由于嗜酸放线菌在代谢前期积累酸过多，导致酶的生成途径受到抑制，镁离子没有起到激活剂的作用。

2.1.4 装液量对纤溶酶活力的影响

在发酵过程中微生物的代谢受多种因素的限制，溶氧量是最易成为限制的因素，影响摇瓶溶氧量的因素为摇瓶的装液量和摇床的转速。所以在摇瓶发酵时，需要对装液量进行优化，筛选出最佳装液量。以葡萄糖2%、牛肉膏0.6%、小米粉1%、氯化钠0.5%、碳酸钙0.2%为培养基，在接种量5%、培养温度22 ℃、摇床转速160 r/min，培养4 d 的条件下，对发酵液装液量进行优化。以30、50、70、90、110 mL（250 mL 三角瓶）改变装液量。

图3 装液量对纤溶酶活力的影响Fig.3 Effect of liquid volume on the fibrinolytic enzyme activity

实验结果如图3 所示，嗜酸放线菌产纤溶酶最适装液量为30 mL/250 mL，最大酶活力达149.28 mm2/10 μL，表明嗜酸放线菌产纤溶酶需要较高的溶氧浓度。这可能是因为在摇瓶发酵时装液量越少，单位体积发酵液的溶氧量越大，放线菌呼吸强度增强，加快其代谢途径，提高酶的产量。

2.2 Plackett-Burman 设计法筛选影响产酶的重要因素

Plackett-Burman 设计法是种部分析因法。根据单因素试验的优化结果，选择培养基成分和培养条件等8 个因素作为优化的输入因子。试验选用N=12 的设计安排，对小米粉（X1）、葡萄糖（X2）、牛肉膏（X4）、碳酸钙（X5）、氯化钠（X7）、pH（X8）、装液量（X10）、接种量（X11）8个因素进行考察，每个因素分别取两个水平，低水平为单因素试验的结果，高水平取低水平的1.25 倍，设计添加3 个空项X3、X6、X9和一个中心点，响应值为酶活力（Y）。试验设计及实验结果见表2。

表2 Plackett-Burman 实验设计和结果Table 2 Experimental design and result of the Plackett-Burman design

运用Design-Expert 软件对表2 的试验结果进行回归分析，并进行方差分析，检验结果见表3。

表3 Plackett-Burman 设计的各因素水平及效应Table 3 The levels and effect of factors for Plackett-Burman design

对产酶的影响最显著的4 个因素依次为：pH＞牛肉膏＞装液量＞接种量，其可信度均＞95%，其它几个因素的可信度均＜95%。说明pH 对嗜酸放线菌的代谢影响特别显著[18]，嗜酸放线菌701 为中度嗜酸放线菌，对pH 有较严格的要求（控制在4.5 至5.5 范围内[10]）。牛肉膏作为氮源对纤溶酶的生成影响较显著，据报道纤溶酶是一种诱导酶[19]，诱导物的存在能增加细胞的产酶速度，提高酶产量。酶本身又是蛋白质，而氮素则是组成蛋白质和核酸的主要元素[17]。装液量主要影响液体培养基中的溶氧浓度，嗜酸放线菌为好氧微生物，增加周围环境中的氧至临界值，可以加强放线菌的呼吸强度。如果溶氧不足，将影响三羧酸循环中一些氨基酸生物合成的前体的生成，阻碍其它氨基酸与蛋白质生物合成，进而影响纤溶酶的生成。

2.3 响应面分析法确定重要因素的最佳水平

由Plackett-Burman 实验可知，在放线菌产纤溶酶的发酵中，pH、牛肉膏、装液量和接种量为影响产酶的四个显著因素。因此本试验以纤溶酶活力为响应值，自变量为pH、牛肉膏、装液量、接种量，分别以X1、X2、X3、X4代表，采用响应面分析法确定各因子最佳水平。各因子编码值及自变量水平见表4、试验设计及结果见表5。

表4 响应面Box-Behnken 组合设计的因素及水平Table 4 The value range and levels of factors for RSM Box-Behnken

表5 响应面试验安排及结果Table 5 Experimental design and result of RSM

利用Design-Expert 软件对表5 数据进行二次多元回归拟合，得到纤溶酶的二次回归方程为：

由回归系数的显著性分析（表6）得知，回归模型F-检验显著，可见纤溶酶响应面试验模型回归显著。

表6 回归系数显著性分析Table 6 The analysis of regression coefficient

由模型方差分析结果见表7。

表7 模型方差分析Table 7 Analysis of variance on the model

由表7 可知，模型回归的p=0.001 5，失拟项的p=0.383 5，说明模型失拟不显著，回归显著，不需要引入更高次数的项，模型适当，决定系数的平方（R-square）为87.88%，表明87.88%的溶圈面积变化可由此模型解释，二次回归方程的拟合程度较好，可以用于放线菌产纤溶酶发酵优化的理论预测。

由于模型回归显著，影响纤溶酶活性的因素依次为X1＞X2＞X4＞X3。二次多元回归方程二次项系数均为负，方程表征的抛物面开口向下，有极大值点。回归方程的响应曲面图及等高线图见图4。通过该组图可对任意两因素交互影响纤溶酶活力大小效应进行分析与评价。对放线菌产纤溶酶的二次回归方程进行模拟寻找最优值，得到纤溶酶最适发酵条件为：pH5.32、牛肉膏1.13%、接种量7.1%、装液量20mL/250mL。在此条件下条件下纤溶酶理论最大酶活力为：233.05 mm2/10 μL。采用上述的最优培养基条件进行3 次重复实验，结果分别为：229.02、227.70、227.78 mm2/10 μL，平均值为228.17 mm2/10 μL，与预测值有较好的拟合性，可见该模型可较好预测实际发酵情况。在初始培养条件下，发酵得到纤溶酶活力平均为161.80 mm2/10 μL。优化后的培养条件下产纤溶酶活力比初始条件下发酵所得纤溶酶活力提高41.02%。

图4 影响纤溶酶活力的重要因素的响应面曲线图Fig.4 Response surface stereogram plots for the effect of important factors on the fibrinolytic enzyme activity

3 结论

对嗜酸放线菌701 产纤溶酶的液体发酵条件进行优化，首先采用单因素试验对放线菌产纤溶酶所需的营养物质进行筛选并优化，得到最优的碳源为葡萄糖，氮源为牛肉膏，装液量为30 mL/250 mL，小米粉最适浓度为1%。在单因素试验的基础上，运用Plackett-Burman 设计从众多影响产酶因素中快速有效的筛选出具有主效应的因子，分别为pH、牛肉膏，接种量和装液量。最后采用Box-Behnken 试验设计建立多项式回归二阶模型，通过优化分析确定各因素的最佳水平。经3次试验验证在初始pH 为5.32、牛肉膏1.13%、接种量7.1%、装液量20 mL/250 mL、小米粉1%、葡萄糖2%、氯化钠0.5%、碳酸钙0.2%、培养温度22℃、摇床转速160 r/min 条件下培养4 d，嗜酸放线菌701 产生的纤溶酶活力为228.17 mm2/10 μL，较优化前提高41.02%。

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