王晶 李超 王业杨 李贵涛

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）的治疗一直是医学界研究的重点和难点，其所导致的截瘫给社会和家庭带来极大的负担。随着分子生物学和细胞工程技术的发展，干细胞移植的疗效己经在动物实验和部分临床试验中得到证实[1]，也为SCI的干细胞治疗带来了希望。目前细胞移植所选用的干细胞主要集中在：骨髓基质干细胞（bone marrow stromal stem cell，BMSC）、单核干细胞、间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）、胚胎干细胞、神经干细胞和嗅鞘细胞[2-3]。由于BMSC较其他移植细胞具有来源广泛、取材容易、在体外长期培养过程中始终保持其多向分化潜能、体内移植反应弱、克服了有关伦理学及免疫排斥问题等优点[4-5]，因此探索BMSC移植治疗SCI具有重要的临床意义。本文就BMSC生物学特性及其移植治疗SCI的研究现状进行综述：

一、BMSC生物学特性及其体外培养

1.BMSC生物学特性：BMSC表达的表面抗原缺乏表型特异性，一般认为其不表达造血细胞表面标记物如 CDla、CD11B（Mac-1）、CDl4、CD27、CD34、CD43、CD45和CDl33，同时也不表达内皮细胞表面标记物如 CDl42、CD312、CD342、CD452，此外 CD50（I-CAM3）、CD53、CDl09、CDll4（G-CSFR)、HLA-2、CCR5（chemokine receptor-5）和L1（neurite adhesion molecule）亦为阴性；而表达H-CAM（CD44）、VCAM-l（CDl06）和CD29，同时在未分化状态下表达一些细胞内标记物（如fibronectin、vimentin、laminin、prolyl-4-hydroxylase）及一些间叶细胞标记物（如SH-2、SH-3及SH-4）[6]。迄今尚无高度特异性的BMSC细胞表面标记物被发现，故无法直接对其进行鉴定，主要是采用流式细胞仪对其表面抗原进行检测，再通过其向其他细胞分化而反证该表面标记物的存在。研究发现，BMSC在无血清培养基中可形成球形细胞团，在形态和表型上与神经球相似，并可表达神经细胞和胶质细胞的表面标记物[7]。Hung等[8]利用流式细胞仪研究了人BMSC可能存在的多种表面抗原，发现对相应的抗体呈阴性的有 CDla、CD14、CD31、CD34、CD45、CD56和ESA。BMSC在组织形态学上主要表现为梭形细胞、巨大扁平细胞和球形细胞三种形态。BMSC在体内有较强的自我更新能力，是永生细胞，具有快速的增殖能力，有较强的黏附性和贴壁能力，多向分化的潜能，在适当的条件下MSC能够分化成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和神经细胞等，并且能够进行跨胚层分化[5,9]，具备了可移植的前提条件[10]。

2.BMSC体外分离、扩增及鉴定：目前用于BMSC的分离方法主要有密度梯度法、贴壁筛选法、流式细胞仪筛选法、免疫磁性选择法等。（1）密度梯度法是根据BMSC与其他细胞的密度不同，将获得的骨髓过滤以去除骨屑，加入分离液（前常用的Percoll分离液，密度1.073 g/ml和Ficoll分离液，密度1.077 g/ml）离心将其分离，BMSC位于界面层（单核细胞层），吸取细胞后置于培养基中进行培养[11]；（2）贴壁筛选法是根据BMSC具有较强的黏附性和贴壁能力，经过一段时间的培养，造血细胞可因其不贴壁死亡或随换液除去，BMSC因贴壁而得以保留[12]；利用BMSC的贴壁特性，经过多次换液后即可去除造血细胞、红细胞等悬浮细胞，从而获得均一性较好的BMSC。该方法具有操作简便、快速实用、对细胞活性影响小等优点[13]；（3）流式细胞仪筛选法是依据BMSC细胞体积小，相对缺少颗粒的特性对其加以分离[14]；（4）免疫磁性选择法是根据免疫学原理，利用包备有抗体的磁珠与BMSC表面抗原特异结合，借助流式细胞仪或一定强度磁场将其分离[15]。其中，密度梯度法和贴壁筛选法是目前提纯BMSC较为常用的分离方法。

BMSC作为修复脊髓损伤的神经细胞的来源细胞能否进而应用于临床，关键在于能否在体外将BMSC定向诱导分化为具有功能的神经细胞。因此在证明BMSC可以在体内分化为神经细胞的同时，不少科研人员开始关注在不同条件的离体环境下诱导BMSC分化为神经细胞，并取得了一定的进展[16]。对于BMSC的诱导方法，较为常用的有化学试剂诱导法、细胞因子诱导法和联合培养诱导法等。Sun等[17]报道，磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C（PC-PLC）-D609钾盐（tricyclodecane-9-yl-xanthogenate）可以诱导BMSC体外分化为具有胆碱能神经功能的神经元样细胞，这些胆碱能神经元样细胞比单纯BMSC移植修复小鼠脊髓损伤的效果更好。Kim等[18]通过脑脊液途径向脊髓损伤1周的小鼠移植人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cell，hMSC）和hMSC 与碱性成纤维细胞生长因子的混合液，发现联合移植组小鼠的运动功能较单纯hMSC移植组恢复好，表明神经营养因子和hMSC联合应用有利于损伤脊髓的组织修复和功能恢复。Sanchez等[19]通过实验配制出了能在体外将BMSC诱导分化为神经细胞的培养液，检测发现诱导后的BMSC转化为具有神经细胞形态的细胞，并表达神经细胞的表面标记物。

Bruder等[20]通过对hMSC在体外培养条件下进行研究，发现hMSC可以在体外分裂（38±4）次，并且维持纺锤形态直至细胞死亡。同时还将一组细胞进行冷冻复苏后传代培养15次，然而细胞的分化增殖能力并未受到影响，提示hMSC具有较强的增殖能力。Chen等[21]研究发现随着供体年龄和细胞传代次数的增加，细胞的增殖能力将呈下降趋势。

目前对于BMSC鉴定的方法都是基于培养过程中出现的分化表型，逆推得知是否为BMSC，尚无直接鉴定方法可得到BMSC，这是因为至今还未能筛选到BMSC特有的标记分子。对CD14、CD34和CD45的阴性反应在筛选时可作为一定的参考依据。

二、BMSC移植修复SCI的机制

目前对于BMSC移植治疗SCI的机制研究尚不完清楚。尽管干细胞具有促进脊髓损伤修复的潜能，但是似乎没有哪一种细胞移植后足以支持强大的再生反应[2]，SCI所造成的神经学损害主要包括原发性损害和继发性损害两种损伤机制，其中以继发性脊髓损害为主要的病理过程[22]。BMSC对SCI节面具有趋向性，因而对新鲜损伤可经血循环移植。Honma等[23]研究证实，中枢神经缺血或损伤后，通过静脉移植，MSC可向损伤局部聚集，并不同程度改善神经功能。Kwon等[24]认为，炎症反应在脊髓损伤引起的继发性损伤中起着重要的作用，一定的炎症反应有利于损伤脊髓的修复，但是过度的炎症反应反而会诱导损伤处少突胶质细胞的凋亡，不利于SCI后的功能恢复。BMSC可在脊髓损伤处分化为神经元和神经胶质细胞[25]，分泌神经营养因子，促进神经元存活和轴突生长，改善SCI患者的预后。Ohta等[26]认为BMSC可能会分泌一些营养物质从而促进内源性细胞增殖、生长。移植的BMSC聚集和充填在SCI的节段，抑制不利于神经再生的胶质瘢痕组织形成，连接脊髓的上下中断。BMSC移植分化而来的神经细胞和星形胶质细胞形成明显的树突，通过与其他神经细胞建立广泛的传入和传出联系，甚至通过重建神经通路，补偿因脊髓损伤破坏而丢失的细胞结构[27]。MSC能够诱导具有功能的肽能神经元出现及神经递质基因TAC1的表达[28]。阮智等[29]研究认为异体BMSC移植能增加损伤脊髓神经生长因子含量，抑制胶质瘢痕形成，促进神经轴突再生，从而促进运动功能恢复。

三、BMSC治疗SCI的安全性与可靠性

虽然大量研究认为干细胞移植是安全的，但仍有少量文献报道干细胞存在潜在的致瘤性[30]。Hofstetter等[31]通过对SCI大鼠进行干细胞移植，发现干细胞在促进脊髓损伤后运动功能恢复的同时，也因神经轴突的异常增生而导致动物痛觉过敏现象出现。患者可将自体BMSC进行体外扩增后自体移植，这样就避免了因组织相容性而引发的免疫排斥反应，同时规避了伦理方面的问题。虽然上述研究所使用的干细胞均不是BMSC，但是不恰当的移植方法可能给患者带来神经源性疼痛或痉挛状态。

四、BMSC治疗SCI的临床应用

由于目前对于干细胞的临床应用存在较为严格的审核措施，BMSC治疗SCI的临床研究报道较少。Moviglia等[32]将BMSC体外联合自身免疫T细胞共同培养获得神经干细胞（neural stem cell，NSC），将获得的NSC经损伤脊髓供血动脉注射治疗慢性SCI患者2例，并对其预后进行跟踪随访：其方法为患者先经静脉注射5×108～l×109个自身免疫T细胞，待48h后，将转分化的NSC经损伤区供血动脉注入，注射完毕后，患者开始接受voita和Bobath神经康复训练。其中1例为19岁男性，T8脊椎水平截瘫，感觉平面为T6，接受了2次移植治疗及6个月的神经康复训练，运动功能恢复至Sl节段，感觉功能恢复至S4节段；另1例为2l岁女性患者，C3～C5水平的SCI，治疗前存在四肢瘫表现，感觉平面为C2，治疗3个月后，运动和感觉平面恢复至Tl～T2，无1例出现不良反应。Pal等[33]将30位招募的颈或胸椎水平的完全性SCI患者按受伤持续时间分为2组，第1组为SCI后6个月以内；第2组为SCI后超过6个月。在局麻下从SCI患者的髂嵴处收集自体骨髓并在体外通过分离扩增获得BMSC通过质量控制测试、特征性细胞表面标记后，再将其按每公斤体重1×106的剂量经腰椎穿刺移植回病人体内。到作者撰文时，已经有3例患者完成了BMSC移植后3年的随访，有10例患者随访了2年，另外有10例患者随访1年，失访5人，未发现BMSC移植相关不良反应。

五、存在问题与展望

作为一种修复中枢神经系统损伤的有效方法，BMSC能够根据不同的治疗目的而达到相应的治疗目标[34]。当前对于BMSC生物学特征及其分化调控机制仍未完全弄清，因此，还需进一步寻找BMSC更准确的表面标记物及在SCI微环境下长时间存活规律，提高SCI轴突的再生能力并引导轴突向合适的目标方向生长，确定BMSC的最佳移植时间和数量等。相信随着研究的不断深入，上述问题的答案会得到一一破解，从而为BMSC治疗SCI研究实现重大突破。

1 Saito F,Nakatani T,Iwase M,et al.Administration of cultured autologous bone marrow stromal cells into cerebrospinal fluid in spinal injury patients: a pilot study[J].Restor Neurol Neurosci,2012,30(2):127-136.

2 Ruff CA,Wilcox JT,Fehlings MG.Cell-based transplantation strategies to promote plasticity following spinal cord injury[J].Exp Neurol,2012,235(1):78-90.

3 Ozdemir M,Attar A,Kuzu I.Regenerative treatment in spinal cord injury[J].Curr Stem Cell Res Ther,2012,7(5):364-369.

4 Vaquero J,Zurita M.Bone marrow stromal cells for spinal cord repair: a challenge for contemporary neurobiology[J].Histol Histopathol,2009,24(1):107-116.

5 Kang ES,Ha KY,Kim YH.Fate of transplanted bone marrow derived mesenchymal stem cells following spinal cord injury in rats by transplantation routes[J].J Korean Med Sci,2012,27(6):586-593.

6 陈秉耀,侯树勋,吴闻文,等.大鼠脊髓损伤后不同时期移植异体骨髓间充质干细胞的局部分布[J].中华骨科杂志,2009,29(2):152-156.

7 Kamishina H,Cheeseman JA,Clemmans RM.Nestinpositive spheres derived from canine bone marrow stromal cells generate cells with early neuronal and slial phenotypic characteristics[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim,2008,44(5-6):140-144.

8 Hung SC,Chen NJ,Hsieh SL,et al.Isolation and characterization of size-sieved stem cells from human bone marrow[J].Stem Cells,2002,20(3):249-258.

9 Cho KJ,Trzaska KA,Greco SJ,et al.Neurons derived from human mesenchymal stem cells show synaptic transmission and can be induced to produce the neurotransmitter substance P by interleukin-1 alpha[J].Stem Cells,2005,23(3):383-391.

10 文芳,王连唐,石慧娟,等.骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞[J].中国病理生理杂志,2004,20(7):1195-1199.

11 Yoo JU,Barthel TS,Nishi K,et a1.The chondrogenic potential of human bone-marrow-derived mesenchymal progenitor cells[J].J Bone Joint Surg,1998,80(12):1745-1757.

12 Friedenstein AJ,Latzinik NV,Gorskaya YF,et a1.Bone marrow stromal colony formation requires stimulation by hematopoietic cells[J].BoneMinet,1992,18(3):199-213.

13 白鹤,赵劲民,杨志,等.大鼠骨髓基质干细胞体外培养及定向诱导分化为成骨细胞的实验研究[J].广西医学大学学报,2007,24(2):259-261.

14 Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et a1.Multilineage potential adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999,284(5411):143-147.

15 Shen LH,Li J,Chen J,et a1.One-year follow-up after bone marrow stromal cell treatment in middle-aged female rats with stroke[J].Stroke,2007,38(7):2150-2156.

16 Choi JS,Leem JW,Lee KH,et al.Effects of human mesenchymal stem cell transplantation combined with polymer on functional recovery following spinal cord hemisection in rats[J].Korean J Physiol Pharmacol,2012,16(6):405-411.

17 Sun C,Shao J,Su L,et al.Cholinergic neuron-like cells derived from bone marrow stromal cells induced by tricyclodecane-9-yl-xanthogenate promote functional recovery and neural protection after spinal cord injury[J].Cell Transplant,2013,22(6):961-975.

18 Kim KN,Oh SH,Lee KH,et a1.Effect of human mesenehymal stem cell transplantation combined with growth factor infusion in the repair of injured spinal cor[J].Acta Neurochir,2006,99(Suppl):133-136.

19 Sanchez RJ,Song S,Cardozo PF,et al.Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro[J].Exp Neurol,2000,164(2):247-256.

20 Bruder SP,Jaiswal N,Haynesworth SE.Growth kinetics,self-renewal,and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation[J].J Cell Biochem,1997,64(2):278-294.

21 Chen TL.Inhibition of growth and difforentiation of Osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment[J].Bone,2004,35(1):83-95.

22 Amar AP,Levy ML.Pathogenesis and pharmacological strategies formitigating secondary damage in acute spinal cord injury[J].Neurosurgery,1999,44(5):1027-1040.

23 Honma T,Honmou O,lihoshi S,et a1.Intravenous infusion of immortalized human mesenchymal stem cells protects against injury in a cerebral ischemia model in adult rat[J].Exp Neurol,2006,199(1):56-66.

24 Kwon BK,Tetzlaff W,Grauer JN,et al.Pathophysiology and pharmacologic treatment of acute spinal cord injury[J].Spine J,2004,4(4):451-464.

25 任长乐,吕德成,纪军,等.骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后功能恢复的影响[J].中华实验外科杂志,2009,26(1):105-108.

26 Ohta M,Suzuki Y,Noda T,et a1.Bone marrow stromal cells infused into the cerebrospinal fluid promote functional recovery of the injured rat spinal cord with reduced cavity formation[J].Exp Neurol,2004,187(2):266-278.

27 Ankeny DP,McTigue DM,Jakeman LB.Bone marrow transplants provide tissue protection and directional guidance for axons after contusive spinal cord injury inrats[J].Exp Neurol,2004,190(1):17-31.

28 PatelN,KlassertTE,Greco SJ,et al.Developmental regulation of TAC1 in peptidergic-induced human mesenchymal stem cells: implication for spinal cord injury in zebrafish[J].Stem Cells Dev,2012,21(2):308-320.

29 阮智,黄慧,孙建华,等.异体骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(36):6729-6732.

30 徐伟伟,姜晓丹.神经干细胞移植治疗应用安全性的研究进展[J].肿瘤,2011,31(1):82-84.

31 Hofstetter CP,Holmstrom NA,Lilja JA,et al.Allodynia limits the usefulness of intraspinal neural stem cell grafts;directed differentiation improves outcome[J].Nat Neurosci,2005,8(3):346-353.

32 Moviglia GA,Fernandez VR,Brizuela JA,et al.Combined protocol of cell therapy for chronic spinal cord injury.Report on the electrical and functional recovery of two patients[J].Cytotherapy,2006,8(3):202-209.

33 Pal R,Venkataramana NK,BansalA,et al.Exvivoexpanded autologous bone marrow-derived mesenchymal stromal cells in human spinal cord injury/paraplegia: a pilot clinical study[J].Cytotherapy,2009,11(7): 897-911.

34 Wright KT,El Masri W,OsmanA,et al.Concise review:bone marrow for the treatment of spinal cord injury:mechanisms and clinical applications[J].Stem Cells,2011,29(2):169-178.