Ott HC 著 王水良 谭建明 译

•研究进展•

人工肺的生物重建和原位移植

Ott HC 著 王水良 谭建明 译

仅在美国，每年约有二千五百万慢性阻塞性肺病患者，其中大约有十二万病人死于终末期肺病。对终末期肺病患者而言，肺移植是迄今唯一疗效确切的治疗手段。但就像其他器官一样，供体肺来源非常有限，以美国为例，在2005年仅四分之一等待肺移植的患者通过全美器官共享网络实现了器官移植，此外，肺移植后的长期效果还常常因慢性排斥反应和免疫抑制治疗的副作用而备受损害。鉴于此，重建自体人工生物肺理论上应可规避上述问题，而为满足移植所需，重建的人工肺应具有与正常供体肺类似功能。此前已有多种方法被应用于构建具有功能的肺组织，从应用高分子多聚物和天然材料如胶原等的结果看来，细胞外基质的作用不仅在于为肺脏提供基础结构并赋予其相应的物理属性，还与肺细胞的分化密切相关。虽然在体外和体内可定向分化为肺结构的成体和胚胎性候选细胞业已分离得到，但由于目前尚无法获得生物可降解的、具高弹性的肺支架以构建气道、肺泡和脉管等肺的复杂结构并满足大面积气体交换之所需，所以重建能通过患者气道通气和脉管系统灌注实质性肺组织的尝试大都无疾而终。

在此前报道的心脏重建以及最近应用于肝脏重建的方法之间，本研究选择尝试通过灌洗法使尸肺去细胞化以获得具有可灌注的脉管床并保留有气道和肺泡几何结构的完整肺支架。近来，基于一种无细胞基质支架而构建的组织工程气道在临床成功植入的报道展示了该法在呼吸系统功能紊乱治疗中极大的潜在应用价值，尽管该结构复杂性相对较低。去细胞化的肺支架在确认保有细胞外基质成分以及完整性和机械属性后，再植入内皮和上皮细胞，通过慢性肺动脉灌流和通气可使其逐步形成具通气、血流灌注和气体交换等功能的重建肺。最后，重建人工肺经原位移植并连接至受体血管和支气管系统后成功地实现了活体内的气体交换功能。

首先，研究人员应用低浓度（0.1﹪）的十二烷基硫酸钠（SDS）在生理性压力下灌洗大鼠尸肺获得了完整的无细胞肺支架。组织学评估显示，灌洗后的肺实质并无细胞核或细胞内其余成分的残存，但仍保留有细胞外基质蛋白。灌洗法去细胞化并不累及气道和脉管系统的基质结构，气道和肺泡的弹性纤维网络的结构也得以完整保存。电子显微镜下观察也表明，除细胞缺失外，气道、肺泡和毛细管网络的基底膜仍完整保留。Western blot蛋白印迹法分析也表明去细胞支架无表面活性蛋白、Clara细胞分泌蛋白（CCSP和CC10）或CD31等蛋白的残余。同时，应用经简单改进的SDS灌洗法也可成功地获得去细胞化的绵羊、猪和狒狒的肺支架，鉴于这些种属的器官大小与人类似，提示该灌洗法在人肺的去细胞化中也具可行性。

通过基于肺特异组织学的形态计量学和体视学法分析发现，与自然肺相比，去细胞化肺的肺泡隔体积百分比下降，相应地间隙体积百分比和肺泡腔体积百分比均上升。不过，二者间肺泡数量和肺泡大小则无显著差异，表明去细胞化肺支架的肺泡隔及其表面积仍保留完好。通过动态肺功能测试发现，去细胞化的肺其顺应性有所下降，肺活量低于正常肺。鉴于在重新植入细胞前再灌注常见有肺和间质水肿，以及表面活性物质的缺乏，去细胞化肺支架顺应性的下降也与预期相符。

为验证去细胞后是否可以再细胞化，研究人员将无细胞的大鼠肺支架置入一特制的、能在恢复气体呼吸功能之前刺激肺发育环境的生物反应器中，再尝试将dsRed标记的人脐带内皮细胞（HUVEC）重新植入无细胞肺支架，结果表明，离体器官在历经5 d的培养后全支架范围内均可见内皮细胞的分散和植入。同样地，为检验支架的生物相容性以及生物反应器和培养条件，研究者又经由气管将人肺泡基底上皮源性癌细胞A549种植入支架，该再植细胞肺在离体器官培养条件下可维系9 d。A549细胞均匀分布，在全肺结构范围内即可见细胞的植入和单层上皮结构的形成，并保有实质结构。

为保留气体交换组织结构，研究者又将大鼠胎肺细胞（FLC）和HUVEC联合种植入去细胞化的尸肺中。待去细胞肺支架的全血管系统再内皮化以后，在小管发育晚期（妊娠第19 ～ 20天）分离大鼠胎肺并经酶消化法制备FLC的单细胞悬液，该细胞悬液再经由去细胞气管滴注入支架。生理条件下，重植入细胞的全肺结构可培养9 d。在培养至第5天时所行的组织学分析发现，全肺支架均可见有上皮和内皮细胞的植入，并保留有大和小气道、肺泡和血管等结构。FLC植入肺细胞外基质并在传导性气道和肺泡形成再生性上皮。重建肺结构的气管和大气道均见衬有无纤毛、无分泌功能的鳞状样上皮，而更远端的气管如远端支气管则可见有立方样上皮的覆盖。在透射电子显微镜下观察还可见，肺泡壁细胞重新植入肺泡隔基底膜，肺泡-毛细血管屏障完整，其厚约0.2 ～ 4 μm，提示已具备满足一定弥散量所需的基本形态结构。此外，重组肺组织经蛋白免疫印迹法分析，结果表明，FLC种植的肺结构在体外培养5 d后可见有表面活性蛋白A和C（SP-A、SP-C）的表达。

形态计量学分析发现，重建肺实质的体积百分比与自然肺相当，但比去细胞化肺高。重建肺的肺泡体积百分比也与自然肺无异，仅略微低于去细胞化肺。立体学法分析表明，重建肺的肺泡数和大小均与自然肺无甚差别。如此看来，去细胞肺支架经内皮和上皮细胞再植并经生理条件下生物反应器中培养后可成功地重建成肺组织，且其肺泡体积、数目和大小与自然肺类似。

鉴于肺组织的首要功能在于允许循环血和吸入气间的气体交换，因此在全器官培养5 d后，研究人员将原来的液相通气改为干性通气以测试重建肺经人红细胞灌注后在生理性通气压力下的气体交换能力。实验各组间灌注液的血气分析并无差异。通过肺静脉流出液的血气分析发现，HUVEC和A549再植重建肺的通气能力接近新鲜分离肺的30﹪；而HUVEC和FLC再植的重建肺的通气能力明显提升，几乎可与新鲜分离的自然肺通气功能匹敌。就动态肺功能测试结果看，HUVEC和FLC再植重建肺的肺活量和肺顺应性均与自然肺相仿。

最后，鉴于FLC再植的人工重建肺在体外的通气力学和通气功能几乎与自然肺相当，故此研究人员将其原位移植以期测试是否它也能在体内正常发挥功能。受体经左肺切除术后，供肺与受体的肺动脉、肺静脉和左主支气管分别吻合以行人工重建肺的原位移植。X射线透视检查示重建肺原位移植后可即实现灌注并行肺通气功能，移植后1 h内未见肺实质出血、肺水肿和气漏等现象，重建肺的X射线透射性也与自然肺相当。所有行左肺切除术的大鼠其肺动脉氧分压均下降，然而，那些再行人工重建肺原位移植的大鼠其动脉氧分压在肺门再通后10 min和30 min时明显改善，而左肺切除但未移植重建肺的对照大鼠动脉氧分压则未见增加。一组实验大鼠在急性实验后任其自行复苏，移植后拔管并在无辅助通气的情况下，生物重建肺的在体气体交换功能可维持至拔管后6 h以上。

综上所述，在本研究中首先通过灌洗去细胞化法获得具三维结构的完整肺支架，再行肺支架表面内皮和上皮细胞共同再植并经体外培养，成功地重建了具备体外和体内通气功能的人工生物肺。同时，人工重建肺原位移植的成功也表明，研究者建立的方法在体外重建肺叶乃至全肺中切实可行，在未来终末肺病患者的肺移植治疗中极具临床意义。在获得去细胞化的完整肺支架后，研究者选择联合HUVEC和源自小管发育期大鼠胚胎的FLC再植，因为这一时期的胚胎已可见Ⅱ型肺泡细胞，但尚未形成成熟的肺泡；亦即这一特殊发育时相的细胞因其既定的肺泡细胞发育定向但仍对基质介导的生长刺激具反应性，因而尤其适用于肺重建试验。此外，为便于人工重建肺组织的成熟，研究者特别设计了能模拟胎肺发育环境的生物反应器，置于其中的无细胞肺支架所承载的机械张力与正常胚胎血液循环和呼吸运动时相类似，并包括了胎肺生长发育所必须的成份。将细胞再植的支架置入生物反应器中培养，可见细胞逐渐嵌入支架并形成内皮、初级呼吸和肺泡上皮。更为重要的是，细胞再植和体外培养可重建具生理厚度的肺泡-毛细血管屏障，从而重建肺换气的形态学基础；且作为肺功能单位的肺泡数目和大小基本与自然肺无异，体外通气和血流灌注也证实了重建肺的生理性通气力学和气体交换功能。该重建肺原位移植入左肺切除的受体后可经受体的肺动脉和静脉实现再灌注，且能通过受体的气管通气。实验大鼠在移植后可成功拔管，并在无辅助通气的情况下呼吸。

诚然，要实现更佳效果的体外器官重建，多环节的进一步优化仍在所难免。首先，再植入重建器官支架细胞的分化和成熟条件尚有待改进；同时，移植前在生物反应器中培养时间的延长也表明重建肺的实质和气管都更为成熟，因而在外形和功能上也更接近自然肺。除了再植细胞的选择，促分化和成熟策略、最佳移植物的获取和理想的重建肺移植术后通气程式都有待进一步的优化。在后续的研究中，重建肺体外培养成熟至何程度即可取得最佳的体内长期移植效果、以及移植后体内成熟和宿主细胞渗入至何程度方可完成器官的重建是有必要重点阐明的问题。

（本文编译自：Ott HC, Clippinger B, Conrad C, et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioarti fi cial lung [J]. Nat Med, 2010, 16(8): 927- 933.)

2013-01-19)

(本文编辑：陈媛媛)

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2013.02.010

Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, USA

Ott HC. 人工肺的生物重建和原位移植[J/CD]. 王水良, 谭建明, 译.中华细胞与干细胞杂志:电子版, 2013, 3(2): 103-105..