段志胜 徐勉 张军 胡祥

•综述•

脐带间充质干细胞治疗糖尿病的研究进展

段志胜 徐勉 张军 胡祥

糖尿病是胰岛β细胞大量破坏，导致胰岛素分泌严重缺乏引起的一组代谢疾病，可出现高血糖，酮症酸中毒等，并由此引发各种临床表现及各系统并发症。随着科学的进步，对糖尿病研究的也进一步深入，各种治疗糖尿病的方法为患者提供了多样的选择机会，从传统的口服降糖药和胰岛素，到糖尿病新指南明确胃转流手术，再到日益成熟的干细胞移植术等。对于1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus T1DM)患者目前常规治疗方法需要终身依赖外源性胰岛素，而且这种治疗只能延缓疾病的病程，而不能从根本上治愈糖尿病，随着疾病的进展，各种并发症会随之而来，严重影响患者的生存质量。目前虽然已有许多胰岛移植、胰腺移植的研究成果，对糖尿病患者也是有效的治疗方法，但供体的来源不足，免疫排斥反应，伦理问题等限制其在临床大量开展。近年来随着干细胞研究的不断深入，干细胞作为一类有自我更新性，多向分化潜能和高度增殖性的非特异性细胞，能够在一定的微环境中分化成某些特定的功能细胞，如胰岛素样β细胞，在糖尿病治疗中的作用也日渐突出，开辟了治疗糖尿病的一条新途径[1-2]。

一、用于糖尿病治疗的干细胞类型

1.胚胎干细胞：胚胎干细胞是受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团的细胞，具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。98年末，两个研究小组成功的培养出人类胚胎干细胞，保持了胚胎干细胞分化为各种体细胞的全能性，使科学家利用人类胚胎干细胞治疗各种疾病成为可能。在治疗糖尿病的研究中，胚胎干细胞在体外可诱导分化为分泌胰岛素的β样细胞[3]，并将分化的细胞移植到链脲菌素诱导的糖尿病小鼠肾被膜下，能使糖尿病小鼠模型的高血糖恢复正常[4]。然而，人类胚胎干细胞的研究工作也引起了全世界范围内的很大争议，出于免疫排斥反应及社会伦理学方面的原因，有些国家甚至明令禁止进行人类胚胎干细胞研究[5]。

2.骨髓干细胞：骨髓干细胞主要由造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)和骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)组成，间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是中胚层发育的早期细胞，由于其低的免疫原性，丰富的成体组织来源（广泛存在于人体的骨髓、脂肪组织、新生儿脐带及胎盘等）及具有多向分化潜能，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为多种组织细胞，并且连续传代培养和冷冻保存后分化潜能不受影响，避免了免疫排斥反应、细胞来源及道德伦理的争议，有望作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复[6]。许多研究发现，BMSC在胰岛微环境中可直接转化为胰岛β细胞，Hess等[7]将BMSC移植到链脲菌素所致的胰腺损伤糖尿病小鼠模型体内，在其相应损伤部位出现绿色荧光蛋白标记的骨髓源性内皮细胞聚集、大多定居在胰小管和胰岛，并出现一定数量分泌胰岛素的阳性细胞，可降低小鼠的高血糖症，证实BMSC可促进胰腺再生，达到治疗糖尿病的目的。

3.脐带来源的干细胞：脐带血(human umbilical cord blood,HUCB)是脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液，含有丰富的干细胞和祖细胞，其主要包含造血干细胞和MSC；脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cell，UCMSC）是一种从脐带华尔通胶质中分离出的新型干细胞,表达MSC的表面标记,不表达或低表达造血细胞和与移植排斥相关的细胞标记[8]。近来随着研究的深入和医学的发展，UCMSC成为一种治疗糖尿病的新方法。

UCMSC其形态和生物学特点与BMSC相似，同样具有多向分化能力，在一定条件下可以分化为骨细胞[9-10]、神经细胞[11]、胰岛素样细胞[12]等。但UCMSC来源更丰富，再生能力强，是成人骨髓干细胞再生能力的10 ～ 20倍；并且脐血干细胞的表面抗原性很弱，不被受体的免疫系统所识别，移植物抗宿主病极少见，可以忽略人类白细胞抗原(HLA)配型问题[13-14]。因此，脐带作为一新干细胞来源，较骨髓中采集的干细胞，有更加易于采集、存储、抗原性小、被病毒及癌细胞污染可能性小等优点[15-16]，正日益受到重视。

二、干细胞技术治疗糖尿病的潜在机制

糖尿病发生的主要机制是胰岛β细胞数量减少和胰岛素分泌功能障碍。利用干细胞技术治疗糖尿病的主要理论依据是干细胞具有多向分化和增殖能力，在一定条件下可以分化成分泌胰岛素的β样细胞，重建内源性胰岛素分泌功能，补充胰岛素的不足，达到降糖目的。在糖尿病相关并发症中，干细胞同样归巢到损伤部位，发挥其“万能细胞”应有的功能，在不同的部位或器官分化成不同的组织细胞，如内皮细胞，表皮细胞，视网膜神经细胞，心肌细胞等，进而改善高血糖造成的各器官损伤。此外，干细胞参与免疫调节、诱导免疫耐受，可重建胰岛的免疫平衡，还可能释放各种细胞生长因子，促进向胰岛β细胞的分化和增殖，达到治疗糖尿病的作用.

三、MSC治疗糖尿病的实验研究与临床应用

1.MSC分化为胰岛分泌细胞：MSC移植治疗T1DM是一种行之有效的方法，在适当的环境下，MSC可以向各种细胞分化。将一定数量的MSC通过动脉导管注入到胰腺等组织中，在胰腺组织微环境的诱导下分化增殖为胰岛样细胞，替代损伤的胰岛β细胞合成胰岛素等功能，起到治疗糖尿病的作用。Gao等[17]采集人类脐血标本将其进行分离，使用细胞外基质胶将人MSC在体外培养分化为胰岛素分泌细胞，观察可见细胞团样结构，胰岛素阳性细胞占诱导细胞的（25.2 ± 3.4）﹪。Chi等[18]也将MSC在体外培养，纯化后的MSC经β羟基乙醇，表皮生长因子及激活素等诱导后细胞形态发生变化，聚集成团，形成胰岛样细胞团，并经胰岛素免疫荧光染色测定，显示阳性反应，而且诱导后的细胞可以分泌胰岛素，并经诱导分化可表达某些胰岛素相关基因如PDX- 1，Ngn3，ILS-1，PAX6，PAX4，GLUT-2等[19]，说明了在体外人类MSC可分化为胰岛样细胞。在临床应用中，MSC同样可以分胰岛素样细胞及胰岛素相关基因PAX-6 PDX-1 ISL-1等，升高血浆胰岛素及C肽水平[20-21]。

2.MSC移植对血糖水平的改善：糖尿病是血糖升高引起的一组代谢性疾病，UCMSC分化的胰岛样细胞，对高血糖有无反应，能否达到降低血糖效果，研究者将UCMSC胞移植到高糖小鼠的肾包膜下，观察在体内降低高血糖的效果，运用化学发光免疫分析研究胰岛素分泌水平和对葡萄糖刺激反应，结果显示可诱导分化出胰岛素阳性细胞，并且可以分泌浓度约为[（0.37 ± 0.06）MU/L]的胰岛素，葡萄糖刺激指数为1.7，证明移植到肾被膜的人UCMSC在体内可降低血糖水平[18]。Ngoc等[22]将来自小鼠骨髓或UCMSC及其诱导分化产生的胰岛素样细胞包裹在海藻酸钠膜形成胶囊，并把胶囊移植到糖尿病小鼠腹腔，通过监测血糖水平作为评价指标，同样发现糖尿病小鼠血糖降低。T1DM是T细胞缺陷的自身免疫性疾病，Zhao等[23]将UCMSC移植到自身免疫性引起糖尿病非肥胖糖尿病（NOD）小鼠体内，不仅高血糖得以逆转，缺陷的CD4+CD62L+调节性T细胞也有改善，证实UCMSC既可以起到免疫调节作用，也可刺激β-细胞再生弥补胰岛素分泌的不足。在临床应用中，Trivedi等[24]用脂肪组织来源的MSCs结合骨髓移植治疗病史0.6 ～ 10年，年龄14 ～ 28岁的5例T1DM患者，静脉输注这些细胞后，没有出现严重的不良反应，胰岛素的需要量降低约30﹪ ～ 50﹪，C肽水平升高明显，血糖控制稳定。

3.MSC对免疫系统的作用：T1DM是T细胞介导的自身免疫性疾病导致的胰腺β细胞选择性破坏，使患者体内胰岛素分泌绝对不足。UCMSC移植，不仅可分化为胰岛素样细胞，达到降糖效果，还可使多种免疫细胞、免疫调节因子、抗体、补体等发生改变，原有的免疫网络被打破，机体重建新的免疫网络[25]。也有报道未分化及分化的MSC均具有免疫抑制作用，它们都不表达或仅表达可忽略低水平的MHC-2类分子，不表达B7-1,B7-2,CD40或CD40L，不能刺激同种异体T细胞，可抑制T细胞的扩增，因而不易被T细胞识别，能逃脱免疫排斥反应[26-27]。国内研究对脐带，骨髓及外周血干细胞的表达情况进行比较，表明UCMSC和其他干细胞对细胞毒性淋巴细胞都有一定的免疫逃逸作用，但对NK细胞的免疫逃逸能力优于其他两种，这可能是UCMSC表明存在一定量的HLA-G，使其对NK细胞具有更强的免疫逃逸能力[28,31]。资料显示UCMSC可以抑制反应性T细胞的增殖，减少T淋巴细胞对胰岛β细胞的损害[29-31]，使Th1细胞向Th2细胞方向转化，提高调节性T细胞的数量[32-33]。这可能是治疗T1DM的一个重要因素。

4.MSC移植对糖尿病并发症的改善研究：随着糖尿病病程的发展，各种慢性并发症相继出现，临床中以糖尿病肾病，下肢血管病变，心脏及视网膜病变多见，对于UCMSC治疗相关并发症的研究及临床应用也已取得突破。Ende等[34]将人脐带血单个核细胞移植到2型糖尿病鼠(B6.Y-Lepob)体内，同样改善了血糖水平，而且肾小球肥大和肾小管扩张也趋于正常化，延长了小鼠的存活率。另有Lee等[35]采用人BMSC修复糖尿病NOD/scid鼠受损的胰岛和肾小球，发现人BMSC能够改善鼠胰腺β细胞功能，促进胰岛素分泌，在观察经MSC治疗后肾脏的变化，可以看到干细胞定位于受损小鼠肾脏部位，能减少炎细胞的渗出及肾小球基底膜的增厚，可分化为肾小球上皮细胞，修复受损肾脏，改善肾功能。

糖尿病足是糖尿病的严重并发症之一，是因糖尿病血管病变和神经病变等因素，导致糖尿病患者足或下肢组织破坏的一种病变，一般治疗难以达到满意的效果，Kalka等[36]证明MSC可诱导生成血管内皮细胞，逐渐形成新的毛细血管，达到促进血管再生，形成新的侧支，改善和恢复患肢血流，同时可诱导生成表皮细胞，使损伤的表皮再生，促进溃疡面愈合。国内Yu等[37]将UCMSC悬液分多点注射到病变下肢，疼痛、冷感明显缓解，有足部溃疡，坏疽的，创面有不同程度的缩小、达到基本愈合，并能降低截肢平面或避免截肢，为缺血性下肢血管病的治疗提供了新思路。

对于治疗糖尿病的相关心脏并发症，Abdel等[38]将MSC移植到糖尿病动物模型中，不仅可以降低血糖，升高C肽，达到降糖效果，还可导致心率，左心室压，心脏收缩指数显著增加，收缩压显著降低，能改善糖尿病患者的心脏功能，达到保护心脏的作用[39]。在另外一项评价心肌梗塞后MSC移植的安全性随机，双盲，安慰剂对照的研究中，表明静脉注射不同剂量的MSC是安全有效的，对心律失常的控制有很好的效果，并且能改善肺功能，增加左心室射血分数，还可抑制心肌重构，促进心肌细胞新生血管形成，提高心肌收缩力和成活力，并能改善糖尿病性心脏病患者心肌梗死发生的预后[40]。

Kicic等[41]对MSC诱导分化为视网膜光感受器细胞进行了体内外实验，结果表明在体外利用维A酸、牛磺酸和EGF大鼠BMSC可诱导分化为视网膜光感受器样细胞，并且约有20﹪～ 32﹪的细胞表达光感受器细胞特异标志性蛋白-视紫红质、视蛋白。利用重组腺病毒转染技术，将标记有绿色荧光蛋白标志的MSC注入到大鼠的视网膜下腔，在体内观察MSC的诱导分化情况，可以看到带有标志的MSC可以整合到视网膜的光感受器细胞层并同时表达光感受器细胞特异性标志，证明MSC可以诱导分化为视网膜神经细胞，同样脐血干细胞移植到体内，可表达人微管相关蛋白、人神经元特定烯醇化酶、视紫红质及分泌多种免疫调节和神经营养因子，起到保护神经的作用，促进视网膜神经细胞的再生[42-43]，为糖尿病并视网膜病变的治疗带来新希望。

四、MSC治疗展望

尽管近年来对MSC的研究取得了很大进展，但目前仍存在不少问题有待解决。首先到目前为止对其还没有十分完善的分离、培养、扩增方案，未能建立统一的鉴定标准，并且培养成功率低，体外培养易分化。在临床应用中MSC进入受体体内后通过归巢到达胰腺中的微环境中，增殖分化成胰岛素样细胞团，分泌胰岛素，达到降糖的作用。但经过全身血液循环到达胰腺，这样是否影响到胰腺定居分化的细胞数量尚有待定论。此外，MSC具有多向分化和增殖的能力，可跨胚层分化，移植体内后是否分化成肿瘤细胞，仍需要长期及大量的研究证实。目前大量研究证实MSC是安全有效的方法，但对于其长期安全性评价及合理化管理还需要更多的时间来对其进行完善，相信随着科学的不断进步，MSC在临床的应用上将有更加广阔的前景。

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2012-04-19)

(本文编辑：蔡晓珍)

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2013.02.008

650101，昆明医科大学第二附属医院老年内分泌科(段志胜、徐勉)；深圳市北科细胞工程研究所（张军、胡祥）

徐勉，Email ：xumian1960@sina.com

段志胜,徐勉,张军, 等. 脐带间充质干细胞治疗糖尿病的研究进展[J/CD]. 中华细胞与干细胞杂志:电子版, 2013, 3(2): 94-98.