路 赛，张诗剑，李 静，王红艳，周利娇，李素婷

(1.承德医学院2011级，河北承德 067000;2.指导教师)

柴胡皂苷是柴胡的主要有效成分，根据其化学结构不同可分为a、b、c、d等，其中以柴胡皂苷d(SS-d)药理作用最强。整体研究表明，SS-d对肝纤维化有一定的防治作用[1]。本实验拟以体外培养大鼠肝星状细胞，观察SS-d对体外培养肝星状细胞增殖的抑制作用，并确定其抑制作用的最佳浓度和最佳时间，以期为SS-d抗肝纤维化的进一步研究提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 肝星状细胞株HSC-T6，购自凯基生物有限公司;DMEM高糖培养基，购自GIBCO公司;胎牛血清，购自Hyclone公司;MTT，购自SIGMA公司;DMSO，购自上海生工。CO2培养箱:日本Taibai LNA-122D;倒置显微镜:德国Olympus;酶标仪:日本BIO-RAD;离心机:上海TGL，16G。

1.2 方法

1.2.1 大鼠肝星状细胞培养:大鼠肝星状细胞株HSC-T6，以含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2混合气体的CO2培养箱中培养，细胞换液时间为1-2d，待细胞长满后用0.25%的胰酶消化，按1:2或1:3传代培养。

1.2.2 细胞分组与药物处理:细胞传代稳定后，大鼠肝星状细胞随机分为空白对照组和SS-d不同剂量组，每组设3个复孔。SS-d组分别给予不同剂量的SS-d，使终浓度 分 别 达 到0.625mg/L、1.25mg/L、2.50mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L、80.0mg/L，空 白 对 照 组常规培养。

1.2.3 MTT法检测不同浓度SS-d对HSC增殖的影响:调整细胞计数为1×105后，均匀接种于96孔培养板中培养，每孔总容积为200μl，各组细胞培养至70%-80%次融合时，0.4%胎牛血清DMEM培养基同步化处理细胞12h后，更换为完全培养基。SS-d组给予不同浓度SS-d，空白对照组加等体积培养基。各组培养24h后，加入5mg/ml MTT20μl，37℃孵育4h，吸弃孔内培养液，各孔加入二甲基亚枫200μl，低速震荡1h，以溶解被还原的MTT结晶，酶标仪双波长检测各孔吸光度值，按下列公式计算大鼠HSC增殖抑制率。细胞抑制率=[1-(实验组A值/对照组A值)]×100%。

1.2.4 MTT法观察不同刺激时间SS-d对HSC增殖的影响:肝星状细胞计数、接种于96孔板中培养同上。选择抑制效果最好的SS-d(2.5、5.0、10.0mg/L)，分别作用12h、24h和36h，对照组加等体积培养基。各孔加5mg/ml MTT20ul，37℃孵育4h，吸弃孔内上清液，各孔加入二甲基亚枫200ul，低速震荡1h，以溶解被还原的MTT结晶，酶标仪双波长检测各孔吸光度值，计算不同时间点SS-d对HSC增殖的抑制作用。

2 结果

2.1 MTT法观察不同浓度SS-d对HSC-T6生长的抑制作用 MTT法检测结果显示，SS-d对大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)的生长有抑制作用，随着SS-d浓度增加，抑制作用明显增加，并呈现量效依赖性(见表1)。但当浓度增加到20mg/L以上时，抑制作用在提高，但细胞存活率小于50%，提示SS-d浓度增加到20mg/L以上时，因SS-d浓度过高对HSC产生毒性作用。因此，选择SS-d抑制肝星状细胞增殖最明显且细胞存活率较高的浓度(2.5、5.0、10.0mg/L)作为最佳实验浓度。

表1 不同浓度SS-d对HSC-T6细胞生长的抑制作用

2.2 MTT法检测SS-d作用不同时间点对HSC生长的抑制作用 选择SS-d对HSC增殖有抑制作用的的最佳浓度，分别作用12h、24h和36h，MTT检测结果显示，SS-d在2.5、5.0、10.0mg/L 范围内作用12h、24h、36h，随着作用时间的延长，抑制作用呈明显的时效和量效关系。见表2。根据实验结果，选择2.5、5.0、10.0mg/L浓度范围作用24h为最佳浓度和最佳时间。

表2 SS-d作用不同时间对HSC-T6增殖的抑制作用(±s)

表2 SS-d作用不同时间对HSC-T6增殖的抑制作用(±s)

相同时间不同剂量之间与前一组比较:aP＜0.05;相同剂量不同时间，24h与12h之间与前一组比较:bP＜0.05。

组别 浓度(mg/L)12h 24h 36h对照组 - 1.245±0.032 1.362±0.070 1.456±0.081 SS-d组 2.50 0.976±0.062a 0.968±0.064a 0.963±0.073a 5.00 0.863±0.062ab 0.856±0.061ab 0.854±0.031a 10.0 0.750±0.051ab 0.711±0.038ab 0.708±0.062a

3 讨论

肝纤维化是由于肝细胞慢性损伤、炎症和不断地组织重建，造成细胞外基质的大量分泌和广泛沉积所致。目前认为，肝星状细胞是肝脏生成细胞外基质的主要细胞，各种刺激因素通过细胞因子介导细胞信号通路激活肝星状细胞，使其大量增殖并发生表型转化，分泌大量细胞外基质沉积于肝脏，是肝纤维化形成并发展到肝硬化的关键环节[2]。寻找有效药物抑制HSC活化增殖，是逆转肝纤维化、防治肝硬化发生的重要策略。SS-d是中药柴胡的活性成分之一，实验证明SS-d可抑制肝细胞内细胞外基质基质的合成，对肾小球系膜细胞的增殖具有一定的抑制作用[3-4]。本实验观察SS-d对体外培养大鼠肝星状细胞增殖的抑制作用，观察其抑制HSC增殖的最佳浓度和最佳时间。本实验结果显示，在一定范围内SS-d对HSC增殖具有一定的抑制作用，且随着时间的延长，抑制效果明显升高，2.5、5.0、10.0mg/L范围内作用24h，可呈现出良好的量效和时效关系，提示抑制肝星状细胞增殖是SS-d抗肝纤维化作用的机制之一。

[1]李素婷，齐洁敏，杨鹤梅，等.柴胡皂苷-d对酒精性肝纤维化大鼠星状细胞活化的影响[J].辽宁中医杂志，2007,34(10):1492-1493.

[2]张春燕.肝星性细胞的活化对肝纤维化形成的影响[J].当代医学，2007，131(12):170-172.

[3]韦燕飞，彭岳，谢海源，等.基于肝星状细胞分子机制的抗肝纤维化研究进展[J].世界华人消化杂志，2009,17(17):1745-1748.

[4]陈爽，贲长恩，杨美娟，等.柴胡皂甙对肝细胞增殖及基质合成的实验研究[J].中国中医基础医学杂志，1999,5(5):21-25.

[5]祖宁，董晞，付桂香，等.柴胡皂苷d 对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质分泌的影响[J].中国中西医结合杂志,2007，27(4):321-324.