许亚娜，许 倩，刘 镭△

(1.承德市妇幼保健院，河北承德 067000;2.承德医学院)

乳腺癌是严重威胁妇女健康的恶性肿瘤，筛查肿瘤生物标记物对早期诊断具有重要意义[1]。本研究通过肿瘤基因组解剖计划(CGAP)SAGE数据库，筛选新的乳腺癌高表达基因，并对其中一条功能未知的新基因CKAP2L进行了初步的生物学分析，为进一步深入研究该基因的生物学功能及其参与乳腺癌发生、发展的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 收集承德医学院附属医院肿瘤科5例乳腺癌组织及对应的癌旁组织(距癌灶边缘＞2cm)，同期5例乳腺纤维瘤组织。

1.2 差异基因的筛选 利用CGAP提供的SAGE Genie数据库，选取数字基因表达演示工具。选择乳腺癌组织和乳腺正常组织两个池，设置F值为16，Q为0.1。

1.3 序列比对 利用BLAST软件检索EST数据库、nr数据库及pro数据库，将所克隆的基因核苷酸序列与GeneBank中已知核苷酸序列进行同源性分析。氨基酸序列相似性分析用NCBI/blastp,多序列比对和进化树分析用clustal W。

1.4 理化性质和亚细胞定位 对蛋白质分子量、等电点、疏水性等理化性质分析用ExPASy-protparam Tool，采用PSORT II server进行亚细胞定位的预测。

1.5 蛋白质结构预测 ELM预测蛋白质功能性位点[2]。信号肽及剪切位点预测用SignalIP，二级结构预测应用SOPMA工具，保守结构域用NCBI/CDD预测。

1.6 电子表达谱分析 通过美国国家生物技术信息中心UniGene库中的EST表达情况分析，获得CKAP2L基因电子表达谱。

1.7 半定量RT-PCR验证性实验 TRIZOL法提取总RNA，按逆转录试剂盒(QIAGEN)操作步骤进行逆转录。PCR反应体系25μl，其中包括2.5μl cDNA 模板，2.5μl 10×PCR反应缓冲液，0.5μl dNTP(10mM)，0.5μl Taq DNA 聚合酶，上下游引物各0.5μl。……