李福荣 胡月华 张 伟 韩俊芬 游桂荣 邢郦健

(1.泰山医学院药物化学教研室，山东 泰安 271016；2.泰山医学院附属泰山医院，山东 泰安 271000)

泰山照山白为杜鹃花科植物照山白(Rhododendrom micranthum Turcz)的枝叶。其中含有各种黄酮类成分如金丝桃苷及多种皂苷、鞣质、油脂和挥发油等, 传统用于祛痰止咳及活血通络等, 有研究显示其浸膏不仅具有平喘、解痉等作用[1-2]，还对舒张动脉平滑肌、降低实验性高血压发挥一定的作用。但是泰山照山白总黄酮对于氧化损伤的神经细胞的作用尚未见报道。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1材料 神经细胞株PC12购于中科院生化细胞所。兔抗人caspase-3多克隆抗体、TNFα、IL-1β酶联免疫试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。二甲基亚砜(DMSO)为北京化工厂产品；RPMI-1640培养基、胎牛血清购自GIBCO公司；MTT购自Sigma公司；胰蛋白酶-EDTA消化液购自北京Solarbio科技有限公司。

1.1.2照山白提取物(RME)的制备 取夏末采收泰山照山白药材250 g, 加入8倍量75%乙醇浸泡过夜, 加热回流提取, 真空抽滤，滤渣重复上述操作合并滤液，50 ℃减压旋转蒸干，洗脱所含木毒素，浓缩蒸干即得RME浸膏58 g 。用80%乙醇定容至10mL，微孔滤膜过滤除菌，存于4 ℃冰箱。

1.1.3细胞培养及干预 将PC12细胞株置于37℃，5%CO2孵箱培养，以10%FBS的RPMI-1640培养液调整适当的细胞密度，接种于25 ml的细胞培养瓶。细胞生长至融合率达70%～80%时，无血清培养12 h使细胞同步化于G0期，加RME进行预处理24 h。分组如下：正常对照组：仅加入DMEM培养基；损伤组：H2O2(150 μmol·L-1)；RME低、中、高剂量预处理组: (10、 20、50 μg·L-1)，预处理后加入H2O2作用12 h。

1.2方法

1.2.1MTT法检测细胞增殖 取对数生长期细胞, 制成1×105/ml的细胞悬液, 接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液100 μl培养过夜，PBS洗涤，按照上述分组处理继续培养24 h后, 加入MTT溶液( 5mg/ml) 10 μl培养4 h, 弃去各孔内液体, 加入100 μl二甲基亚砜，振荡器振荡5 min, 室温放置10 min，全自动酶标仪上测定各孔A490 nm值，取3孔平均值计算细胞抑制率:抑制率%=(1-实验组A值/对照组A值) ×100%。

1.2.2ELISA 法检测上清TNFα、IL-1β含量 细胞分组以及处理同上，收集各分组细胞培养上清液，ELISA 法检测TNFα、IL-1β的产生量，操作按试剂盒说明进行，酶标仪 450 nm 处测定 A 值。

1.2.3免疫荧光组织化学法检测 caspase-3 的表达 调整 PC12 细胞密度为 1×106/ml ，制作细胞爬片，培养于6孔板内, 待细胞贴壁过夜后加入无血清 RPMI-1640 培养液12 h, 使细胞同步化。加入三个浓度的RME预处理 12 h 后, 加入H2O2(150 μmol·L-1) 损伤 12 h，加入caspase-3一抗孵育, 4 ℃过夜， PBS洗涤3 次，加入二抗孵育2h， PBS冲洗, 磷酸甘油缓冲液封片，免疫荧光显微镜观察。

1.2.4统计学处理

2 结 果

2.1RME对损伤PC12 细胞存活率的影响 与空白对照组相比, H2O2模型组的细胞存活率明显降低( 63.72%，P<0.01)； 经RME预处理后，细胞存活率升高为73.71% 、82.76% 和 89.27%，与H2O2损伤组比较, 差异显著(P<0.05,P<0.01)。见图 1。

图1 MTT检测RME对细胞活性的影响

注：*P<0.01vs对照组，#P<0.05vs损伤组，##P<0.01vs损伤组

A: 正常对照组; B: 损伤组; C: 10 μg·L-1RME; D: 20 μg·L-1RME; E: 50 μg·L-1RME

2.2RME对培养液上清TNFα、IL-1β含量的影响 TNFα、IL-1β等炎性细胞因子是引起慢性炎症和严重损伤的重要因素。实验结果表明，与空白对照组比较，H2O2模型组IL-1β水平增加 51.34% (P<0.01)，TNFα 含量增加 37.49%(P<0.01)；而与H2O2模型组比较，RME预处理组的TNFα分别降低31.15%、25.52% 和20.52%(P<0.05,P<0.01)；IL-1β含量分别下降为37.01%、21.77%和20.56% (P<0.05,P<0.01)。见图 2、图3。

图2 RME对培养液上清TNFα含量的影响

注：*P<0.01vs对照组，##P<0.05vs损伤组

A: 正常对照组; B: 损伤组; C: 10μg·L-1RME; D: 20 μg·L-1RME; E: 50 μg·L-1RME

图3 RME对培养液上清IL-1β含量的影响

注：*P<0.01vs对照组，##P<0.05vs损伤组

A: 正常对照组; B: 损伤组; C: 10μg·L-1RME; D: 20μg·L-1RME; E: 50 μg·L-1RME

2.3RME预处理对PC12凋亡的影响 与空白对照组比较，H2O2损伤12 h后，PC12细胞caspase-3的表达明显增加，而RME三个剂量组均可明显降低PC12细胞caspase-3的表达，且呈剂量依赖性效应。见图4。

图4 RME干预对PC12细胞caspase-3表达的影响

A: 正常对照组; B: 损伤组; C: 10μg·L-1RME; D: 20μg·L-1RME; E: 50μg·L-1RME

3 讨 论

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD) 发病原因十分复杂，现普遍认为是一种以神经纤维缠结、β-淀粉样蛋白斑形成、神经元丢失为主要病理特征的进行性退化性神经系统变性疾病，发病机制尚未明了，但目前研究认为脑内的慢性炎症反应继而诱发神经细胞的凋亡可能是其重要发病机制之一，而氧化应激诱发的自由基损伤是导致神经元凋亡的根本原因，因此抗氧化是保护神经元的有效途径[3-4]。H2O2是诱导氧化应激反应的活性氧之一，其在体内代谢过程中产生的OH-是氧化性最强的氧自由基，可自由进入细胞，在许多神经元细胞培养模型中可引起细胞损伤，因此本研究以H2O2作为损伤因素处理细胞,制备氧化应激损伤模型，研究中药照山白的抗氧化作用。

据《本草纲目》记载，照山白具有活血、通络、祛风、散寒等功效，改善全身的血液循环，固标治本，扶正驱邪。已有研究显示，服用20%照山白酊，经临床观察200例，降压总有效率为74%。有研究显示，照山白酊剂中主要药效成分金丝桃苷，具有抗炎、解痉、利尿、止咳、降压、降低胆固醇、蛋白同化、局部和中枢镇疼以及对心、脑血管的保护作用等多种生理活性，是一种重要的天然产物。能有效抑制缺氧缺糖-再灌注损伤后脑片甲躜(formazan)含量下降，增加缺血区脑片皮层和纹状体的存活神经元数目，使神经元细胞形态完整，分布良好。抑制SOD、LDH及谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活性的下降。其作用机制可能与自由基清除，抑制Ca2+内流及抗脂质过氧化物形成等有关[5-6]。

本研究中经H2O2损伤后PC12细胞的存活率下降；介导炎性损伤的重要的白介素家族成员TNFα、IL-1β的合成与表达增加；caspase-3的表达也明显增高。提示TNFα、IL-1β在早期的氧化损伤刺激时释放量增多，是参与氧化损伤、凋亡的重要细胞因子。 而照山白总黄酮预处理后，则显示可明显抑制炎性细胞因子TNFα、IL-1β的合成与表达；抑制凋亡相关蛋白caspase-3表达，且此效应呈剂量依赖性。

本研究结果提示，抑制炎症反应的发生、保护细胞免于炎性损伤以至于凋亡可能是照山白总黄酮发挥抗氧化和抑制神经细胞株PC12凋亡的作用机制。

[1] 宋立仁, 洪恂, 丁绪亮, 等. 现代中药学大辞典[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2001：40-80.

[2] Ducrey B, MarstonA, Gohring S, et al. Inhibition of 5 alphareductase and aromatase by the ellagitannins oenothein A and oenothein B from Epilobiumspecies[M]. Planta Med, 1997, 63(2): 111-114.

[3] Cagnin A. Positron emission tomography imaging of neuro inflammation[J]. Neurotherapeutics, 2007, 4: 443-452.

[4] Quinn J. Inflammation and cerebral amyloidosis are disconnected in an animal model of Alzheimer's disease[J]. J Neuroimmunol, 2003, 137: 32-41.

[5] 杨秀岭, 袁志芳, 张兰桐, 等. 照山白总黄酮药理作用研究[J]. 中草药, 2006, 37(4): 583-585.

[6] 夏重道，杜安全，王红萍，等照山白有效成分的化学研究[J].中国药科大学学报，1999，13(4)：99.