陈丹，黄飞飞，曹杰，黄少宇，章梦奇，谭峰

（温州医科大学，浙江 温州 325035，1.第一临床学院；2.基础医学院）

弓形虫病（toxoplasmosis）是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）引起的、严重危害宿主健康的人兽共患寄生虫病。人们常因生食或半生食含有弓形虫包囊的动物肉类而感染。

目前，微波炉已成为人们生活中的常用家用电器。研究证实，家用微波炉可有效地杀灭白色念珠菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌等一些病原体[1-2]。因此，本实验将经过不同功率、不同时间微波处理后的弓形虫PRU株包囊灌饲小鼠，并对感染小鼠从SAG1-PCR、抗弓形虫IgG抗体效价检测与脑组织包囊计数三方面来评价经微波处理后的包囊是否仍具有感染性，探寻利用微波炉杀灭弓形虫包囊的最佳条件，为家庭预防弓形虫病提供依据。

1 材料和方法

1.1 弓形虫虫株与实验动物 弓形虫成囊株PRU株由本实验室于小鼠体内常规保种。ICR小鼠，雌性，18～22 g，购自温州医科大学实验动物中心。

1.2 引物与试剂 根据弓形虫SAG1参考核苷酸序列设计并合成引物，上游引物：5’-GCTGTAACATTGA GCTCCTTGATTCCTG-3’，下游引物：5’-CCGGAACAGTACT GATTGTTGTCTTGAG-3’，扩增片段长度为355 bp。格兰仕微波炉（型号：wd900sl23-2；额定频率：2450 MHz；额定输出功率：900 W；额定输入功率：1400 W）；弓形虫抗体（Tox-IgG）ELISA检测试剂盒购于珠海海泰生物制药有限公司；DNA提取试剂盒（Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0）为Takara公司产品；PCR引物由Invitrogen公司合成；PCR检测试剂盒为TianGen公司产品。

1.3 包囊收集 感染弓形虫PRU株包囊的小鼠经颈椎脱臼法处死，取脑组织匀浆，计数包囊总数。

1.4 微波炉处理包囊 实验组共分8组，按不同温度分为高温组、中温组与低温组，其中高温组分为30 s与1 min 2个处理组；中温组分为1 min、3 min与5 min 3个处理组；低温组分为1 min、5 min与10 min 3个处理组。将脑组织匀浆液分为8份，以0.9%氯化钠溶液调整至250个包囊/（8 mL·份），按上述不同温度、不同时间微波处理包囊。

1.5 动物感染 50只ICR小鼠随机分成10组，5只/组，将上述微波处理后的包囊按50个/只灌饲小鼠。以未经微波炉处理组作为未处理组（阳性对照组），阴性对照组只灌饲同等体积的0.9%氯化钠溶液。灌饲当天作为第0天，记录各组小鼠的存活时间。42 d后对存活小鼠进行以下评价实验。

1.6 评价实验

1.6.1 ELISA法检测：42 d后，对存活小鼠眼眶取血，分离血清，按照Tox-IgG-ELISA检测试剂盒说明书检测各组小鼠血清中IgG抗体效价。

1.6.2 包囊计数：取血后将小鼠脱颈处死，制备脑组织匀浆，于低倍镜下计数包囊总数。

1.6.3 PCR检测：将各处理组与未处理组各取1 mL脑组织匀浆，按DNA提取试剂盒说明提取DNA。PCR反应体系：引物、dNTP、2×Master Mix。总体积为10μL，反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，共35个循环；最后72 ℃延伸7 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳分析结果。以直接提取的PRU株包囊DNA作为阳性对照。将5份阴性对照组DNA合成1份作为PCR的阴性对照。

1.7 统计学处理方法 采用SPSS 11.0统计软件进行统计学分析。各组抗体效价差异比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠存活状况 整个实验过程中，低温1 min组有2只小鼠死亡，分别死于感染后第13天和第39天；低温10 min组有1只小鼠死于感染后第11天；未处理组有1只小鼠死于感染后第5天；其余小鼠感染后均未死亡，统一于感染后第42天处死。

2.2 脑组织内包囊计数 低温1 min组小鼠脑组织包囊总数为（655.56±363.79）个/只，未处理组小鼠脑组织包囊数为（833.33±274.03）个/只，两组差异无统计学意义（P＞0.05）。其余各组存活小鼠脑组织内均未检出包囊。

2.3 血清IgG抗体水平 低温1 min组小鼠血清IgG抗体A450值为1.18±0.23，未处理组小鼠血清IgG抗体A450值为0.86±0.22，两者差异无统计学意义（P＞0.05）。其余各组ELISA法检测结果均为阴性。2.4 SAG1-PCR结果 低温组中只有低温1 min处理组所有3个样本中均检测出弓形虫SAG1基因，其余各组基因检测均为阴性（见图1）。而中温各组（见图2）、高温各组（见图3）都有部分样本扩增出弓形虫SAG1基因。

图1 低温组弓形虫SAG1基因检测结果

图2 中温组弓形虫SAG1基因检测结果

图3 高温组弓形虫SAG1基因检测结果

3 讨论

弓形虫病已成为人类第二大重要食源性疾病[3]。有研究证明，食入夹生肉不仅可引起弓形虫病的暴发[4]，同时也是孕妇感染弓形虫最可能的原因[5-7]。迄今为止尚未发现有效的弓形虫药物和疫苗，故切断传播途径显得尤为重要。许多研究已证实微波炉能有效杀灭一些寄生虫、细菌等微生物。张国华等[8-9]分别利用微波炉对肉中旋毛虫幼虫包囊和华支睾吸虫囊蚴进行处理，证实微波炉对两种病原体均有一定的杀灭作用。鉴于此，本实验用微波炉处理弓形虫PRU株包囊，以探索杀灭包囊的最佳条件。

弓形虫抗体IgG和IgM是弓形虫感染的重要血清标志物，其中IgG抗体虽产生时间较晚，但持续时间长，利用ELISA法检测抗弓形虫IgG抗体具有较好的敏感性及特异性[10]。本实验ELISA法检测结果显示未处理组与微波炉低温处理1 min组呈阳性，两组血清IgG抗体A450值分别为0.86±0.22、1.18±0.23，两者差异无统计学意义（P＞0.05），其余各组均为阴性。镜检结果显示未处理组与低温1 min处理组的包囊数分别为（833.33±274.03）个/只、（655.56±363.79）个/只，且两者差异无统计学意义（P＞0.05），其余各组均未查出包囊。通过将包囊检查与IgG检测结果对比发现，只有IgG效价高的组别检测到包囊，表明低温1 min不能杀伤弓形虫包囊。

PCR技术作为一种新型的分子生物学方法，自诞生以来，由于它的特异性、敏感性、能在短时间内得到大量目的片段的优势，使之在弓形虫检测应用中得到广泛应用，并取得较好的检测效果。崔平等[11]就将PCR运用于猪弓形虫病的检测，其建立的方法以SAG1基因为引物最低能检测到5个弓形虫速殖子的DNA，且与相关的2种寄生虫无交叉反应，具有高度的敏感性和特异性。鉴于此，本实验将PCR技术用于对小鼠弓形虫包囊感染的检测，并在检测过程中设立了阳性对照，阴性对照和未处理对照，结果显示低温1 min组均扩增出了目的基因，其结果与IgG-ELISA、包囊镜检结果一致，从而进一步证实低温处理1 min的包囊仍然具有感染性。

然而，通过PCR技术检测结果发现，在IgG-ELISA与包囊镜检结果均为阴性的高温组、中温组中均有部分样本扩增出弓形虫SAG1基因，特别是中温5 min组中有1份样本呈现阳性，但是低温5 min组中所有样品的基因检测却是阴性。因此，目前还不能妄下断言其他条件就可以杀灭包囊。不难看出不管是镜检、ELISA法还是PCR技术都有一定的局限性，但PCR技术显然具有更高的灵敏度。故在评价食物中是否有弓形虫感染的时候不应仅凭某一种检测方法来判断，而应当加入基因检测。

本实验基因检测部分结果与包囊计数和ELISA法检测结果有一定出入，故可对ELISA法检测结果显示阴性而PCR技术检测结果显示阳性的样本是否仍具有感染性进一步检验。此外，由于本实验是将脑组织匀浆后采用固定体积（8 mL）放入微波炉进行处理，而实际生活中大多数为肉片，若将脑组织匀浆换成感染弓形虫的小鼠肉片更接近实际，但在实际操作中很难得到有包囊的肉片；再者，本实验微波处理的样本均是常温脑组织匀浆，与生活中冷冻肉解冻前的冰冻状态有所不同，其微波处理想获得相同处理效果，需要获得更多热量。由于市面上微波炉型号不同、功率不同、新旧不同，相同条件处理效果也必将不尽相同。另外，李荣芬等[12]证明，微波杀菌、杀死虫体除了热效应外，主要还有非热效应—微波机制，故适当延长微波作用时间同样可起到杀灭包囊作用。鉴于以上，在实际生活应用中应根据实际情况调整微波处理温度和时间。

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