郑培君 蒋爱民 邱 美 沈科能

（华南农业大学食品学院，广东 广州 510642）

双酶法酶解猪瘦肉蛋白工艺优化研究

郑培君 蒋爱民 邱 美 沈科能

（华南农业大学食品学院，广东 广州 510642）

为制备腊味香精提供更丰富的前体物，以猪瘦肉为原料，水解度为指标，选用Alcalase和Flavourzyme为试验用酶，通正交试验优化双酶法水解猪瘦肉蛋白最佳工艺条件。结果表明：Alcalase和Flavourzyme水解瘦肉蛋白其最佳条件为，pH 9时，用1 000U／g Alcalase于60℃下水解6h，再用2 500U／g Flavourzyme于50℃、pH 4.5继续水解4h。此时，水解度达到34.82%，比Alcalase和Flavourzyme单酶水解度分别提高34.12%和27.48%，且酶解产物还含有丰富的制备腊味香精的前提物。

腊味；肉蛋白；双酶法；酶解

肉香味是人类饮食中最重要的香味之一，热反应是肉味香精形成的最主要的途径之一［1］。猪瘦肉具有全面丰富的营养物质和风味物，特别是含有能显示出各种肉香味特征的类脂类物质，通过蛋白酶酶解瘦肉肉蛋白可以获得很多肉味前体物质，如游离氨基酸、胺、多肽等［2］，这些氨基化合物与羰基化合物可进行羰氨反应（Maillard热反应，后简称热反应），产生醛、酮、酯类等具有特殊风味的物质［3］，故以猪瘦肉酶解蛋白液进行热反应得到的肉味香精更具逼真和强烈的肉味香气及优良的产品性能。

蛋白酶水解氮源物质，再经美拉德反应制备肉味香精是肉味香精的主流技术。陈祖杰等［4］等利用蛋白酶解鲢鱼肉生产复合调味料。谭斌等［5］以牛肉为底物，通过商品化蛋白酶制备牛肉水解物作为Maillard的反应物，并对酶解产物对美拉德反应风味形成的影响进行了探讨。陈能飞等［6］研究了酶法水解猪血红蛋白制备肉味香精的工艺。徐德峰等［7］选用复合蛋白酶对鸡骨架蛋白进行酶解，运用响应曲面法对酶解工艺进行优化，酶解液可作为美拉德反应制备肉味香精的优质底物。传统的中式腊味肉制品独特腌腊风味的主要成分多为脂肪的水解氧化产物、蛋白质水解产物以及美拉德反应产物。本试验采用双酶法优化蛋白水解工艺，使得蛋白水解液成为适合热反应制备腊味香精的优质前提物。

但是，酶法水解的动物蛋白有一定的苦味。苦味肽的端基多为疏水性氨基酸，若用外切酶切除此类疏水性氨基酸，游离出的疏水氨基酸与原苦味肽相比苦味要低得多［8］。风味蛋白酶既是内切酶也是外切酶，因此风味蛋白酶在一定程度上能有效脱苦，所以本试验采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶双酶水解，旨在改善水解效果的基础上得到更优质的蛋白液。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪瘦肉：冷藏，广州市好当家连锁超市；

木瓜蛋白酶（800U／mg）、胰蛋白酶（3 500U／g）、碱性蛋白酶（200U／mg）：广州市齐云生物技术有限公司；

中性蛋白酶（1.5AU／g）、复合蛋白酶（1.5AU／g）、风味蛋白酶（4×104U／g）：北京诺维信生物技术有限责任公司；

氢氧化钠、甲醛、盐酸等：分析纯，广州化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

高速分散均质机：FJ－200，上海标本模型厂；

数显恒温水浴锅：HH－4，常州澳华仪器有限公司；

精密pH计：PHS－3C型，上海虹益仪器仪表有限公司；

离心机：Centrifuge 5804R，上海艾本德生物技术国际贸易有限公司；

全自动凯氏定氮仪：Kjeltec 8200，瑞典Foss公司；

电子分析天平：BSA124S型，德国Sartorius公司。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

瘦肉→清洗、解冻、绞碎→加水，预煮→调pH→加酶→酶解→灭酶，煮沸15min→4 000r／min离心20min→过滤，冷却→瘦肉蛋白水解液

1.3.2 总氮量测定 凯氏定氮法，参照 GB／T 5009.5——2010。

1.3.3 游离氨基态氮的测定 甲醛电位滴定法，参照GB／T 5009.39——2003。

1.3.4 水解度的测定 水解度DH表示原料蛋白质中肽键被裂解的百分数，即蛋白质被酶催化水解的程度［9］。水解度按式（1）计算：

式中：

DH—— 水解度，%；

N0—— 样品总氮含量，%；

N1——酶解前游离氨基态氮含量，%；

N2——酶解后游离氨基态氮含量，%。

1.3.5 酶解条件单因素设定 单因素试验设计采用同种试验原料，以水解度为评价指标，研究不同蛋白质浓度、pH、温度、时间和加酶量对蛋白酶水解效果的影响。

1.3.6 两种酶水解条件的优化 在单因素试验确定了 Alcalase（碱性蛋白酶）和Flavourzyme（风味蛋白酶）在蛋白质浓度、pH值、温度、水解时间、加酶量对瘦肉蛋白水解度的影响的基础上，为得到两种酶水解瘦肉蛋白的最佳条件，选择加酶量、pH、温度、时间4个因素对这两种酶分别做4因素3水平正交试验。

2 结果与分析

2.1 水解酶的确定

试验测得瘦肉蛋白含量为21.81%。以瘦肉为底物，分别用木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶，碱性蛋白酶、复合蛋白酶、胰蛋白酶，用去离子水调整蛋白浓度为9%、按表1各酶粗略水解条件进行酶解。

表1 各酶粗略水解条件Table 1 The rough enzyme hydrolysis conditions

由图1可知，水解效果较好的是风味蛋白酶和碱性蛋白酶，碱性蛋白酶水解后水解液色泽呈透亮的淡黄色，澄清度较好，风味蛋白酶水解后水解液澄清，有很好的肉香味，复合蛋白酶水解液体较浑浊，胰蛋白酶水解液有明显异味，木瓜蛋白酶及中性蛋白酶水解度相对较低，这与袁永俊等的结果［10］不同，在水解鱼肉蛋白酶解工艺采用胰蛋白酶及胃蛋白酶水解效果较好，这可能是由所采用的原料不同所致。综合考虑上述结果，筛选出碱性蛋白酶和风味蛋白酶为水解酶。

图1 不同蛋白酶对瘦肉酶解效果的影响Figure 1 Effect of protease on hydrolysis efficiency of Pork protein

2.2 单因素结果分析

2.2.1 蛋白浓度对水解度的影响 由图2可知，风味蛋白酶在蛋白质浓度为6%时上升速率最高，9%之后趋于平缓。而碱性蛋白酶的趋势变化不大。随着猪瘦肉蛋白质浓度增大，酶与底物的接触机率增大，酶解开始时水解度快速上升；随着蛋白质浓度的增大，整个反应体系呈胶状，流动性减弱，导致酶与底物的作用机率减弱，在水解度达到最大之后开始有平缓或降低趋势［11］。考虑到节约能源，降低成本，所以碱性蛋白酶、风味蛋白酶最佳蛋白质浓度均为9%。

2.2.2 初始pH值的变化对水解度的影响 由图3、图4可知，pH对水解效果的影响较显著。pH值影响酶的稳定性，对水解反应影响很大，故各种酶都有各自的最适pH值范围。碱性蛋白酶在pH 8.5左右时，水解度最大，为21.76%，风味蛋白酶在pH 5.0左右时，水解度最大，为27.09%，故碱性蛋白酶和风味蛋白酶最适pH值分别取8.5和5.0。

图2 蛋白质浓度对水解度的影响Figure 2 Effect of protein concentration on hydrolysis degree

图3 pH值对风味蛋白酶水解效果的影响Figure 3 Effect of pH value on Flavourzyme hydrolysis

图4 pH值对碱性蛋白酶水解效果的影响Figure 4 Effect of pH value on Alcalase hydrolysis

2.2.3 温度对水解度的影响 由图5可知，温度对水解效果的影响较明显。在一定温度范围内随着反应温度升高，水解度不断增加，但超过一定温度后，水解度会随着温度的升高而降低。这是因为在一定范围内升高温度，反应速度加快，酶解效率也相应提高，但温度过高，酶蛋白变性［12］，酶稳定性下降，酶解效率随之降低。所以，Alcalase和Flavourzyme的最适温度均为55℃。

2.2.4 时间对水解度的影响 由图6可知，随着时间的增加，水解度不断增加，当增加到一定程度，增加的速度开始变慢，这是由于随着水解的进行，蛋白质底物逐渐减少，酶解产物不断积累对酶本身造成抑制［13］。综合考虑效率与成本的问题，单因素水解时间Alcalase为5h，Flavourzyme为3h。

图5 温度对水解度的影响Figure 5 Effect of temperature on hydrolysis degree

图6 反应时间对水解度的影响Figure 6 Effect of reaction time on hydrolysis degree

2.2.5 酶添加量对水解度的影响 由图7可知，随着加酶量的增大，两种酶的水解度都在增大，当加酶量达到2 000U／g蛋白时，Flavourzyme的水解度达到28.46%，随后其水解度变化不大，当加酶量达到1 500U／g蛋白时，Alcalase的水解度达到25.87%，随后其水解度增加缓慢。

图7 加酶量对水解度的影响Figure 7 Effect of protease dosage on hydrolysis degree

2.3 两种酶水解条件的优化

在单因素试验确定了Alcalase和Flavourzyme在pH、温度、时间、加酶量对瘦肉蛋白水解度的影响的基础上，为得到两种酶水解瘦肉蛋白的最佳条件，选择pH、温度、时间、加酶量因素对双酶分别做4因素3水平正交试验因素水平见表2、表3，结果表见表4、表5。

表2 L9（34）Alcalase正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experimental design of Alcalase

表3 L9（34）Flavourzyme正交试验因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal experimental design of Flavourzyme

表4 Alcalase正交试验结果表Table 4 The results and analysis of orthogonal experiment

由表4、表5可知，pH对Alcalase水解度的影响最大，其次为温度、时间和加酶量，最佳方案为A2B2C2D2，即加酶量为1 500U／g，pH为8.5，温度为55℃，水解时间为5h。该条件下瘦肉蛋白的水解度为22.94%。同样对Flavourzyme做正交试验，得出其最佳水解条件为加酶量2 000U／g、pH 5.0、温度55℃、水解时间4h，该条件下水解度为26.25%。底物浓度均为9%。

表5 L9（34）Flavourzyme正交试验结果表Table 5 The results and analysis of orthogonal experiment

2.4 双酶组合对水解度的影响

根据表4、表5得出的最佳水解条件，向同样底物浓度为9.0%的猪肉悬浮液中加入 Alcalase酶水解6h后高温灭酶，然后调至Flavourzyme酶的最佳水解条件，加入Flavourzyme酶水解（或改变加入双酶的水解顺序），测定水解度，并与单一酶的水解度比较，结果见图8。

图8 水解酶加入方式的比较Figure 8 The Comparison of the hydrolas ezyme addition method

由图8可知，双酶法比单独使用一种酶酶解的水解度明显提高，比Alcalase和Flavourzyme单酶水解度分别提高34.12%和27.48%，所得产品水解彻底，为 Maillard反应制备腊味香精提供优质的前体物。这与陈晶等的研究结果［14］较为相似。

3 结论

采用Alcalase酶和Flavourzyme酶双酶分布水解瘦肉蛋白的最佳条件：蛋白浓度9.0%，pH 9.0时，加1 000U／g蛋白质Alcalase酶于60℃水解6h；酶水解后高温灭酶，再用2 500U／g蛋白Flavourzyme酶于pH为4.5、温度为50℃下继续水解4h。在此工艺下，瘦肉蛋白的水解度可达34.82%，比单独用Alcalase酶和Flavourzyme酶水解水解度分别提高34.12%和27.48%，且此条件下得到的酶解液肉香浓郁，无苦味，多肽及氨基酸种类多，有丰富的制备腊味香精的前体物可以用于腊味香精的研发。

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4 陈祖杰，邓后勤，夏立新，等.酶解鲢鱼肉生产复合调味料［J］食品与机械，2009，25（5）：153～155.

5 谭斌，丁霄霖，刘立国.牛肉蛋白水解舞的特性及其模式体系的Maillard反应［J］.食品科学，2004，25（11）：64～68.

6 陈能飞，丁霄霖.酶法水解猪血红蛋白制备肉味香精的研究［J］.中国调味品，2006（3）：35～38.

7 徐德峰，张卫明，孙晓明，等.鸡骨架蛋白酶制备肉味香精反应底物的研究［J］.中国调味品，2007（6）：36～38.

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10 李清春，张景强.水解蛋白的特性及在食品中的应用［J］.食品工业，2001，4（3）：7～9.

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12 Pinto E Silva M E M，Mazzilli R N，Cusin F.Composition of hydrolysates from meat［J］.Journal of Food Composition and Analysis，1999（12）：219～225.

13 王亚林，陶兴无，钟方旭.碱酶两步法提取米渣中蛋白质的工艺研究［J］.中国油脂，2002，27（3）：53～54.

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Study on the optimization hydrolysis condition of lean pork protein with twice enzymolysis method

ZHENG Pei－jun JIANG Ai－ming QIU Mei SHEN Ke－neng

（College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong510642，China）

For the preparation of meat flavor to provide more abundant precursors，taking lean pork meat as raw material，degree of hydrolysis as an index，Alcalase and Flavourzyme were chosen as the two tool－enzymes.For the sake of getting the optimum conditions of two－enzyme hydrolysis，the orthogonal experiment was conducted.The results showed that the optimum conditions of enzymatic hydrolysis was hydrolyzing protein with 1 000U／g Alcalase at pH 9.0，60℃for 6hours and then with 2 500U／g Flavourzyme at 50℃，pH 4.5for another 4hours，its hydrolysis degree could be reached 34.82%.Compared with those of hydrolyzing with Alcalase and Flavourzyme alone，hydrolysis degree were increased by 34.12%and 27.48%，respectively，and full of precursor of meat flavors for Millard reaction.

Cured and roasted meat；lean protein；twice enzymolysis method；enzymatic hydrolysis

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.01.060

广东省重大专项（编号：2009A020101002）

郑培君（1988－），女，华南农业大学在读硕士研究生。E－mail：peijun99＠yahoo.com.cn

蒋爱民

2011－08－01