马杨，卢士玲，李开雄，李宝坤

(石河子大学食品学院，新疆石河子，832000)

新疆特色酸凝奶酪是新疆哈萨克地区少数民族最喜爱的乳制品之一，它是依靠乳酸菌发酵产酸达到酪蛋白的等电点，从而使酪蛋白凝固而制成。奶酪中的风味化合物包括原料乳中的风味化合物以及成熟过程中产生的化合物，可以分为挥发性的风味物质和非挥发性的风味物质。非挥发性风味物质即水溶性风味物质，主要包括蛋白质分解产物如氨基酸和肽、游离脂肪酸、有机酸如乳酸等，这些风味物质对奶酪滋味的强烈程度有很大影响。

外国学者对奶酪非挥发性风味物质做了大量且深入的研究。Lawlor［1］等人对8种硬质奶酪的挥发性、非挥发性风味物质以及感官特性之间的相互关系做了研究，结果表明挥发性风味物质、游离氨基酸、游离脂肪酸和奶酪的独特风味紧密相关。Andersen［2］等人对成熟切达奶酪水溶性物质中的滋味成分进行了研究，发现谷氨酸、矿物质盐和有机酸是主要的滋味成分。而国内对奶酪中非挥发性风味物质的研究较少，尚处于起步阶段。马玲［3］和郑小平［4］分别对酸凝奶酪和霉菌奶酪的游离氨基酸进行了研究，而国内对于奶酪中有机酸和游离脂肪酸的研究比较少见。

本研究旨在了解酸凝奶酪成熟过程中非挥发性风味物质含量的变化规律，同时为评价其工艺和合理控制奶酪成熟过程提供理论依据，并对制作出营养美味的酸凝奶酪具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 试剂

0.01 mol/L H3PO4-NH2PO4缓冲液(pH=2.4)、乙腈、甲醇、H2SO4、甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、丙酸、丹磺酰氯、冰乙酸、乙酸钠、四氢呋喃、氨水、CH3CH2OH、乙醚、石油醚，以上试剂均为分析纯，氨基酸混合标准液(色谱纯)、37种脂肪酸甲酯混合标准品(色谱纯)

1.2 设备

液相色谱仪，日本岛津;气相色谱仪，日本岛津;冷冻离心机(Neofuge 15R)，力康发展有限公司;水浴锅。

1.3 方法

菌种:乳酸乳球菌∶瑞士乳杆菌=1∶1。

牛奶:石河子大学动物科技学院实验站提供。

酸凝奶酪加工工艺:原料乳的选择→杀菌→添加乳酸菌发酵剂→发酵→切割→吊袋排乳清→入模成型→干燥→成品

1.3.1 有机酸测定方法

1.3.1.1 标准品混合液的配制

准确称取甲酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、丙酸各0.500 0g，用超纯水溶解后定容至50mL，此为标准储备液，取5 mL储备液定容至50 mL，为标准使用液。将标准使用液稀释成5个不同的浓度梯度，峰面积采用外标法进行定量分析。

1.3.1.2 样品预处理

准确称取奶酪样品0.5 g，研磨均匀后置于10 mL容量瓶，加8mL浓度为0.01 mol/L的H2SO4溶液振荡30s后定容，离心(8 000 g)10 min，取清液经0.45 μm滤膜过滤，待测。

1.3.1.3 色谱条件

流动相:甲醇和缓冲溶液(浓度为0.01 mol/L的NaH2PO4，pH=2.6)体积比为 3∶97，流速为 0.8 mL/min，紫外检测波长为210 nm，柱温为30℃，进样量为10 μL。

1.3.2 氨基酸测定方法

(1)样品处理:奶酪与去离子水以1∶2(m/V)混合，匀浆后50℃水浴保温40 min，然后在4℃下4 000 r/min离心30 min，去除上层脂肪和下层沉淀，中层清液通过玻璃绒过滤后得到水溶性提取物。取250 μL 样液，100 μL(2 moL/L)KHCO3，200 μL 4 g/L 丹酰氯丙酮，混匀后置于80～90℃水浴下40 min，取出后加入200 μL 1 mol/L HCl终止反应，冷却，高速离心12 000 r/min，10 min。取上清液进样测定。

(2)流动相 A:2.72 g乙酸钠，180 μL三乙胺溶解于1L超纯水中，再用1%冰醋酸调pH值为7.20，再加3.0 mL混合，用0.22 μm水系膜过滤。脱气处理后于4℃下避光保存。

流动相B:2.72 g乙酸钠加水至200 mL，用1%冰醋酸调pH值为7.20，加400 mL乙腈，400 mL甲醇混合，脱气备用。

17种氨基酸标准溶液:复合氨基酸标准溶液，用0.01 mol/L HCl稀释成不同浓度梯度，峰面积采用外标法进行定量分析。

色谱条件:色谱柱为C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温 40℃，进样量:20 μL，流速 0.8mL/min，洗脱梯度:0～13 min(B:0% ～15%)，13～14 min(B:15% ～23%)，14～29 min(B:23% ～30%)，29～35min(B:30% ～35%)，35～38 min(B:35% ～40%)，38～45 min(B:40% ～68%)，45～55 min(B:68% ～70%)，55～57 min(B:70%)，57～60 min(B:70% ～0%)，60～62 min(B:0%)。

1.3.3 脂肪酸测定方法

(1)脂肪提取:参照GB 5413.27-2010。

(2)甲酯化:称取脂肪50 mg于5 mL容量瓶中，加入1%H2SO4-甲醇2 mL，70℃水浴加热30 min，加入2 mL正己烷，再加蒸馏水至瓶颈，取出上清液，再用1 mL正己烷洗1次，合并上清液，放入小瓶中待测。

(3)脂肪酸甲酯混合标准液用正己烷稀释成不同浓度梯度，峰面积采用外标法进行定量分析。

(4)色谱条件:色谱柱为DM-Wax，30 m ×0.25 mm ×0.25 μm;进样口温度:250℃;检测器温度:280℃;升温程序:50℃保持1 min，以25℃/min升至200℃，再以3℃/min升至240℃，保持18 min。

2 结果与分析

2.1 酸凝奶酪成熟过程中有机酸含量变化

有机酸是大多数成熟奶酪中重要的风味成分，其含量和构成适宜时，能赋予奶酪柔和的酸味，但是当其含量超过一定的阈值时，其酸味不协调。

表1显示了酸凝奶酪成熟过程中有机酸含量的变化。分析可知，有机酸总量和各种有机酸含量变化都极显著(P＜0.01)。随着成熟时间的延长，有机酸总量持续积累，从第10天的7.84 mg/g增加到50天的15.51 mg/g。

表1 酸凝奶酪成熟过程中有机酸含量(mg/g)

乳酸在奶酪成熟过程中产生的主要有机酸，是由乳酸菌发酵乳糖产生的，它的含量与成熟时间是一致的。有研究表明，它在不同奶酪中的含量为1.94～17.4 mg/g［5］。在酸凝奶酪中检测到大量的乳酸，成熟50 d的酸凝奶酪乳酸含量为10.75 mg/g，占总有机酸含量的69.31%，在上述结论范围内。

由表2可知，苹果酸含量也是随着成熟时间的延长而增加的，最终含量达到2.94 mg/g。

乙酸也是靠乳酸菌代谢乳糖产生的，或者由柠檬酸、乳酸代谢和氨基酸的代谢产生的。已有报道在很多奶酪中比如:Cheddar、Provolone等奶酪中乙酸的含量范围是0.13 mg/g到2.96 mg/g。表2显示酸凝奶酪成熟50 d时乙酸含量是0.95 mg/g。

柠檬酸含量在成熟50 d时是0.87 mg/g，在所有检测到的有机酸中含量最低，Ong［6］认为可能是由于柠檬酸被微生物代谢生成了风味物质，如乙酸、乙醛和双乙酰。

2.2 酸凝奶酪成熟过程中氨基酸含量变化

游离氨基酸的形成可以认为是奶酪成熟和发酵剂适应性的标志，同时游离氨基酸影响奶酪的口味和余味。由表2可知，在酸凝奶酪成熟过程中氨基酸总量变化显著(P＜0.05)，从第10天的75.48 mg/100 g增加到第50天的166.34 mg/100 g，说明随着奶酪的成熟，它的营养价值也在不断的提升，这一结果比马玲［3］对酸凝奶酪和 R.Di Cagno［7］等人对意大利PDO 奶酪的测定值高，而比 Mangia［8］、Marta Bertolino［9］等人的研究结果低。

表2 酸凝奶酪成熟过程中游离氨基酸含量(mg/100g)

不同的奶酪氨基酸含量有明显的变化，可能与奶酪的生产工艺(牛奶的卫生状况、牛奶的贮藏温度、凝乳酶的添加量、乳清排出温度、凝乳压榨等)和成熟环境(贮藏类型、温度、湿度)等因素有关［10］。在酸凝奶酪成熟第10天时，甘氨酸、组氨酸、精氨酸没有检测到;成熟20 d时，甘氨酸和精氨酸检测到，只有组氨酸没有检测到，到奶酪成熟30 d时所有的氨基酸都能检测到，说明随着奶酪的成熟，氨基酸的种类在不断地增加;到成熟50 d时几乎所有构成蛋白质的氨基酸，包括7种必须氨基酸和10种半必须氨基酸都能检测到。

从主要游离氨基酸的分布来看，在成熟10 d时，组氨酸、亮氨酸、酪氨酸是主要氨基酸，含量占总量的38.73%，在成熟50 d之后，主要游离氨基酸有缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，含量在总量的50.76%，成熟初期和成熟后期优势氨基酸相似，缬氨酸和亮氨酸一直是主要氨基酸，但有些氨基酸没有一直处于主要氨基酸的状态，这是由于微生物产生的酶使大分子肽水解成氨基酸和小分子肽。所有奶酪成熟期间游离氨基酸分布状况决定于微生物的活性，当乳球菌和乳杆菌加入到奶酪中缬氨酸和亮氨酸就会大量存在［11］，而新疆特色酸凝奶酪采用的菌种就是乳酸乳球菌和瑞士乳杆菌，所以缬氨酸和亮氨酸含量较高。

从单个游离氨基酸在成熟期间变化趋势来看，不同的氨基酸都以不同的方式进行积累，并不是所有的氨基酸含量都是在一直增加的。比如丝氨酸、谷氨酸含量都是先增加，之后一直处于下降趋势，天冬氨酸含量在前30 d内是增加的，40 d时下降，而到50 d时又增加，还有一些氨基酸如组氨酸和精氨酸在成熟初期没有检测到，成熟30 d后含量一直增加，这说明氨基酸含量一直处于动态变化的过程，有学者认为这与氨基酸的水解有关。

游离氨基酸种类和含量的增加有助于提高奶酪的营养价值，丰富奶酪的口感，并且游离氨基酸可以进一步分解生成挥发性风味物质。

2.3 酸凝奶酪成熟过程中游离脂肪酸含量变化

表3 酸凝奶酪成熟过程中游离脂肪酸含量 mg/100g

游离脂肪酸在奶酪的基本味道上有重要作用，但如果游离脂肪酸含量过高会产生一些不快的气味，因此奶酪生产过程中应控制游离脂肪酸含量。

表3显示了酸凝奶酪成熟过程中游离脂肪酸含量的变化，可知游离脂肪酸总量变化差异极显著(P＜0.01)，在成熟50 d内，从139.35 mg/100 g增加到236.16 mg/100 g。和其他研究结果相比，比 Franco［11］对 Babia-Laciana奶酪研究得出的结果稍高，与Wit［12］等人对切达奶酪的研究结果相似。众所周知，影响奶酪中游离脂肪酸含量的主要因素有:奶的种类和质量、加热处理、乳酸菌发酵剂的使用、成熟和贮藏温度、盐水浓度、奶中的脂肪酶以及建立于凝乳酶之上的脂肪酶。上述结论可能的解释是:一方面，研究表明由羊奶制成的奶酪比牛奶制成的奶酪成熟过程中总游离脂肪酸含量低，这是由于羊奶中的脂蛋白酶只有一小部分与酪蛋白胶粒相连被留在奶酪中，还有可能是牛奶中酪蛋白和自身脂肪酶相互作用比羊奶要强［13］，酸凝奶酪和Wit等人研究的切达奶酪使用的是牛奶，而Babia-Laciana奶酪使用的是羊奶，由此可以印证这一结论。另一方面，本实验奶酪贮藏温度是10℃，和Wit等人采用的8～12℃相符，而与Franco等人的条件5℃有差别，有研究表明，贮藏在10～20℃的奶酪脂肪分解率比贮藏在5℃的要高。

从单一游离脂肪酸含量来看，并不是所有的游离脂肪酸都以相同的速率变化的，C4:0、C6:0、C8:0、C10:0、C12:0含量变化差异极显著(P ＜ 0.01)，C14:0、C16:0、C18:1、C18:3含量变化差异显著(P＜0.05)，只有 C18:2在成熟期间含量变化差异不显著(P＞0.05)，M.De Wit等人得出C18:2含量变化差异不显著的相同结果。短链脂肪酸(C4～C8)对奶酪特殊香气的形成有重要影响，由表4可知，在整个过程中短链脂肪酸变化差异都极显著，C4:0是主要的短链游离脂肪酸，Poveda，Cabezas［14］2006 年已报道。C14:0是主要的中链脂肪酸。中短链脂肪酸含量的增加利用人体消化利用，奶酪营养价值明显提高。

从主要游离脂肪酸的分布来看，C18:1，C16:0，C14:0含量最高，占游离脂肪酸总量的56.64%，但它们对奶酪的风味并没有贡献。

3 结论

通过对新疆特色酸凝奶酪成熟过程中非挥发性风味物质有机酸、游离氨基酸、游离脂肪酸含量变化的分析可知，有机酸含量随着成熟时间的延长而增加，有机酸总量适中，赋予奶酪柔和的酸味，其中乳酸是主要的有机酸;而游离氨基酸种类随着成熟时间的延长增加，总量变化显著，提高了奶酪的营养价值，丰富了奶酪的口感，而单一氨基酸含量处于动态变化的过程;游离脂肪酸总量随着成熟时间的延长而增加，短链脂肪酸含量显著增加，中链脂肪酸含量也有所增加，更有利于人体消化吸收，使奶酪营养价值更高。

［1］ Lawlor J B，Delahunty C M，Wilkinson M G，et al.Relationships between the gross，non-volatile and volatile compositions and the sensory attributes of eight hard-type cheeses［J］.International Dairy Journal，2002，12(6):493-509.

［2］ Andersen L T，Ardo Y，Bredie W L P.Study of taste-active compounds in the water-soluble extract of mature Cheddar cheese［J］.International Dairy Journal，2010，20(8):528-536.

［3］ 马玲，徐静.酸凝干酪成熟过程中游离氨基酸含量的变化［J］. 山西农业科学，2008，36(9):66-68.

［4］ 郑小平，陈有容，郭本恒.高效液相色谱法分析霉菌干酪中游离氨基酸含量［J］.上海水产大学学报，2003，12(3):282-284.

［5］ Kaminarides S，Stamou P，Massouras T.Changes of organic acids，volatile aroma compounds and sensory characteristics of Halloumi cheese kept in brine［J］.Food Chemistry，2007，100(1):219-225.

［6］ Ong L，Shah N P.Probiotic Cheddar cheese:Influence of ripening temperatures on survival of probiotic microorganisms，cheese composition and organic acid profiles［J］.LWT-Food Science and Technology，2009，42(7):1 260-1 268.

［7］ Cagno R D，Banks J，Sheehan L，et al.Comparison of the microbiological，compositional，biochemical，volatile profile and sensory characteristics of three Italian PDO ewes’milk cheeses［J］.International Dairy Journal，2003，13(12):961-972.

［8］ Mangia N P，Murgia M A，Garau G，et al.Influence of selected lab cultures on the evolution of free amino acids，free fatty acids and Fiore Sardo cheese microflora during the ripening［J］.Food Microbiology，2008，25(2):366-377.

［9］ Bertolino M，Dolci P，Giordano M，et al.Evolution of chemico-physical characteristics during manufacture and ripeningof Castelmagno PDO cheese in wintertime ［J］.Food Chemistry，2011，129(3):1 001-1 011.

［10］ Gorostiza A，Alexandre J C，Alice T V，et al.Changes in soluble nitrogenous compounds，caseins and free amino acids during ripening of artisanal prato cheese;a Brazilian semi-hard cows variety［J］.Food Chemistry ，2004，85(3):407-414.

［11］ Franco I，Prieto B，Bernardo A，et al.Biochemical changes throughout the ripening of a traditional Spanish goat cheese variety(Babia-Laciana)［J］.International Dairy Journal，2003，13(2-3):221-23.

［12］ Wit M D，Osthoff G，Viljioen B C，et al.A comparative study of lipolysis and proteolysis in Cheddar cheese and yeast-inoculated Cheddar cheeses during ripening［J］.Enzyme and Microbial Technology，2005，37(6):606-616.

［13］ Atasoy A F，Turkoglu H.Lipolysis in Urfa cheese produced from raw and pasteurized goats’and cows’milk with mesophilic or thermophilic cultures during ripening［J］.Food Chemistry，2009，115(1):71-78.

［14］ Poveda J M，Cabezas L.Free fatty acid composition of regionally-produced Spanish goat cheese and relationship with sensory characteristics［J］.Food Chemistry ，2006，95(2):307-311.