武耸荔 赵彦程 李 红 杨雪艳 王红艳 陈 瑛

神经管畸形(NTDs)是一种由于胚胎发育早期因神经管不闭合或闭合不完全所造成的常见的中枢神经系统出生缺陷［1］，由遗传和环境因素共同作用［2～4］。目前国内外多集中于与神经管发育相关基因的突变研究［5～8］，随着首次在NTDs 患者中发现3 个VANGL1 基因特有的杂合性错义突变［5］，随后筛查发现了FUZZY 基因在3 例NTDs 患者中特有的杂合性错义突变［8］，这些研究均提供了人类神经发育相关基因突变可能会导致NTDs 发生的证据。

ZIC2 是ZIC 锌指家族5 个成员之一。ZIC 家族基因编码锌指转移因子，其结构上包含进化上高度保守的5 个串联C2H2锌指结构［9］。ZIC2 编码的转移因子在神经发育过程中起着极其重要的作用，参与神经管和神经嵴的形成［10］。小鼠Zic2 基因敲除或Zic2 表达量下降会导致NTDs 产生，表型为前脑裂畸形和脊柱裂［11］。在人群中，ZIC2 杂合基因突变，即13q32 区域杂合性缺失会导致前脑裂畸形［12］。由于ZIC2 进化上保守，同时在小鼠神经管闭合中起着重要作用，而小鼠神经管发生的机制与人类极为相似，因此ZIC2 基因突变可能会引发人类NTDs。有系列研究在人类NTDs 患者中进行了ZIC2 基因突变筛查，但并未发现任何致病性基因突变或与NTDs 相关的SNP［13～15］。然而上述结果均来自对欧美人群的筛查，迄今缺乏中国NTDs 人群的筛查结果。另一方面，既往报道大多以脊柱裂存活患者为研究对象，但若ZIC2 基因为致死性突变，则携带该突变的个体就难以发育至成熟。基于以上考虑，本研究在扩大样本量的基础上，征集因严重NTDs 死亡或流产的中国人群胎儿DNA 样本，对ZIC2 外显子进行突变筛查。

1 方法

1.1 NTDs 样本来源 与文献［6］的样本相同，由2 部分组成:①山西医科大学基础医学院和山西长治医学院提供的NTDs 胎儿脐带血抽提的DNA 样本142 份;②江苏省苏州市立医院母子健康研究中心提供的NTDs 胎儿脐带血样本21 份。所有样本均经孕期B 超确诊，部分样本同时经病理学解剖证实为NTDs。均为有明显NTDs 症状同时不伴有其他重大出生缺陷(如先天性心脏病)的胎儿。

1.2 对照样本来源 由3 部分组成:①山西医科大学和山西长治医学院提供的正常生产健康胎儿脐带血样本96 份和健康成年妇女血样192 份;②山西长治医学院提供的健康成年男性血样192 份;③江苏省苏州市立医院提供的健康成年人血样96 份。所有对照样本由医院进行常规体检，确认无NTDs、先天性心脏病、智力低下、精神分裂症、糖尿病、高血压和癌症等出生缺陷和重大疾病。

1.3 伦理学 本研究经复旦大学生命科学院伦理委员会批准，胎儿由其父母签署知情同意书，成人由其本人签署知情同意书后进入本研究。

1.4 ZIC2 基因突变筛查

1.4.1 DNA 提取 使用传统酚-氯仿法抽提DNA。蛋白酶K 购自Sigma 公司，乙醇、酚、氯仿、异戊醇、碳酸氢钠等试剂均为上海试剂厂产品;抽提出的DNA 采用Thermo Scientific 公司的Nanodrop 2000 分光光度计测定DNA 浓度。

1.4.2 PCR 扩增 针对外显子设计PCR 扩增引物，从基因组上扩增外显子序列，引物序列见表1，由上海生工生物技术有限公司合成。PCR 使用TAKARA 公司产品，包括HSTaq 酶、反应缓冲液、dNTP，以及提供的相应体系和扩增条件。ZIC2 Exon3 序列GC 含量较高，采用LATaq 酶(TAKARA 公司)扩增。

1.4.3 ZIC2 外显子区域的突变筛查 取PCR 扩增产物进行测序。采用美国ABI 公司的Bigdye 试剂盒和3730 遗传分析仪进行检测。结果采用Seqman 软件分析。测序发现的突变进行反向测序验证，并对NTDs 组中发现的突变在对照组中测序，验证是否为NTDs 特有的突变。

表1 ZIC2 基因编码区PCR 扩增引物序列Tab 1 Primers for amplification of ZIC2 coding region

2 结果

通过对NTDs 163 份胎儿DNAs 标本进行ZIC2 编码区测序，发现一个同义突变c.1140G ＞A(图1)，未发现错义突变或重复缺失。同义突变c.1140G ＞A 位于第2 外显子(图2)，为1 例妊娠期37 周诊断为枕部脑膜脑膨出的女性胎儿。KEGG 数据库分析ZIC2 结构发现该同义突变位于ZIC2 的一个C2H2锌指结构中，该同义突变在对照组中进行基因分型未检测到相同突变。

图1 NTDs 病例中发现的同义突变c.1140G ＞A 测序图Fig 1 Sequencing result highlighting the mutation c.1140G＞A in case

图2 NTDs 病例中发现的突变在ZIC2 中位置Fig 2 Location of ZIC2 rare mutation identified in NTDs cases

3 讨论

ZIC2 位于染色体13q32，其氨基酸序列高度保守。ZIC家族参与哺乳动物胚胎发生时期一系列发育过程，包括早期神经格局、神经嵴发育、小脑发育和左右对称等［10］。在早期发育期ZIC 家族基因功能有重叠，但不同基因突变产生不同表型［11］。已有大量动物实验表明ZIC2 参与神经发育过程，ZIC2 基因敲除会出现NTDs 表型［12，16，17］。小鼠和人中发现Zic2 突变会造成前脑裂畸形、脊柱裂、神经形成延迟和神经嵴发育延迟［13］。Zic2 纯合突变小鼠胚胎缺失背外侧铰链点(DLHP)不能形成闭合神经管最终导致严重的脊柱裂，尤其是脊柱后端［16］。人类中也发现ZIC2 杂合基因突变，即13q32 区域杂合性缺失会导致前脑裂畸形［12］。目前在西方人群中完成的针对ZIC2 基因突变与NTDs 的相关性研究中，并未在ZIC2 中发现NTDs 患者特有的可以改变氨基酸序列的罕见基因突变［13，14］。Brown等［14］在173 例有西班牙裔种族背景的NTDs 患者中进行ZIC2 突变筛查，其中95%病例患有腰骶脊柱裂，5%病例患有脑膨出或其他类型NTDs，结果并未发现可导致读码框改变的突变，却发现第1 外显子中存在CAC 重复多态(c.718－720dupCAC)与NTDs 发生相关。但后续针对该位点在西班牙人群和南美人群中的深入研究结果并不支持该多态性位点与NTDs 发生相关［15，18］。此外在来自荷兰的NTDs 人群研究中也没有发现该多态性位点的存在，但该项研究在1 例男性脊柱裂患者ZIC2 第1 外显子发现1 个丙氨酸密码子缺失(c.94－96delGCG)，该突变遗传自患者未患病的母亲和外祖母［13］。

本研究NTDs 样本均为因严重NTDs 而流产的胎儿，研究发现与既往欧洲人群样本的研究结果一致，并未在ZIC2中发现NTDs 患者特有的可以改变氨基酸序列的罕见基因突变，同时也未检测到c.718－720dupCAC 多态性位点和c.94－96delGCG 突变位点，进一步说明了ZIC2 蛋白序列的保守性和功能重要性。在NTDs 人群中发现的众多专属罕见突变及其功能研究表明这些罕见突变可能是造成NTDs 的原因［5～8］。本研究发现一个位于C2H2锌指结构的精氨酸同义突变，由于没有父母样本不能判断是否为新发突变，但在正常对照组中测序结果显示该同义突变是NTDs特异性的突变位点。虽然同义突变不会改变氨基酸序列，但是可能会影响ZIC2 蛋白正常生理功能的行使，甚至对其翻译效率造成影响，因此该位点潜在的功能效应尚需进一步验证。

本研究是首次在中国人群中进行与NTDs 相关的ZIC2基因突变筛查，与既往欧美人群中筛查ZIC2 基因突变研究不同的是，本研究采用的病例DNA 样本来自极端严重NTDs 的流产胎儿，旨在找到可能与NTDs 发生关系更密切、致病效力更强的致命性突变。与来自其他人群的研究结果类似，本研究在严重NTDs 病例中并未找到ZIC2 基因错义突变。

综上所述，来自不同种族NTDs 人群的研究结果表明ZIC2 基因未检测到编码区错义突变。考虑到小鼠中Zic2基因敲除或者突变导致的各种NTDs 表型，推测有可能ZIC2 基因错义突变将导致更早期的人体胚胎发育障碍，可能是早期胚胎自然流产的原因之一;因此在发育后期(孕15 周后)或者NTDs 存活患儿中检测不到ZIC2 突变。只有在NTDs 病例中确认ZIC2 基因的启动子、内含子、3'UTR甚至基因拷贝数有无变异后，才能够全面确认ZIC2 基因与人群NTDs 发生的关联关系。

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