王晓映 刘 鹏 朱 华 徐艳峰 马春梅 代小伟 刘 颖 秦 川

(中国医学科学院实验动物研究所 北京协和医学院比较医学中心，北京 100021)

阿尔茨海默病(AD)是一种神经系统退行性疾病，是导致老年人痴呆的主要原因，其特征性的病理改变是在大脑皮质和海马区域出现老年斑和神经原纤维缠结。目前，AD的发病机制仍然不明确，一些研究发现，凋亡的异常可能在AD的发生发展过程中起到重要作用。本实验以APPswe/PSΔE9模型小鼠作为研究对象，探讨AD中凋亡相关蛋白的表达情况。

1 材料与方法

1.1 APPswe/PSΔE9转基因小鼠的建立 APPswe/PSΔE9转基因小鼠由中国医学科学院实验动物研究所构建并提供〔1〕。APPswe转基因编码一段人鼠嵌合的蛋白，其中APP的胞外和胞内区域为鼠源性序列，而Aβ结构域为人源性序列并包含瑞士突变K594N/M595L。PSΔE9转基因编码人源性E9外显子缺失的PS1。转基因小鼠在出生9～14 d用剪趾法标记，收集剪下的组织及鼠尾，用碱裂解法提取基因组DNA，PCR分别检测APPswe及 PSΔE9基因的表达。APP基因 PCR产物长344 kb，PS基因PCR产物长608 kb。

1.2 Western印迹法检测bcl-2、caspase-9以及活化caspase-3的表达 将小鼠脱颈处死后，迅速取出其脑组织，用生理盐水洗去血液，立即置于RIPA蛋白裂解液中，提取总蛋白。蛋白浓度用BCA法进行测定。蛋白上样量为40 μg，利用12%的SDSPAGE胶进行分离，然后将其转移至NC膜(Millipore)上，室温下封闭 1 h，与 bcl-2(Abcam)、capase-9(Millipore)及 caspase-3(Abcam)抗体进行杂交，4℃过夜，用TBST洗膜3次，与辣根酶标记的羊抗兔IgG和GAPDH进行杂交，室温下孵育1 h，TBST洗膜3次，然后进行化学发光。

1.3 统计学分析 运用SPSS11.0统计软件。用t检验对Western印迹的结果进行统计学分析。

2 结果

2.1 APPswe/PSΔE9转基因小鼠鼠尾DNA鉴定结果 裂解鼠尾后提取DNA，分别用针对APP，PS1的引物进行扩增，筛选鉴定阳性小鼠，部分检测结果见图1。

图1 APPswe/PSΔE9转基因小鼠鼠尾DNA PCR鉴定结果

2.2 APPswe/PSΔE9转基因小鼠和对照小鼠脑组织中bcl-2蛋白的表达情况 利用Western印迹的方法分别检测了3月龄和6月龄小鼠脑组织中bcl-2蛋白的表达情况，并将检测结果进行半定量分析。由图2可以看出，与同月龄的野生型对照小鼠相比，APPswe/PSΔE9转基因小鼠中，bcl-2表达水平明显降低。每个月龄均用了12只小鼠，其中6只为模型鼠，6只为同月龄的野生型对照鼠。为了保证实验结果的准确性和可重复性，所有实验均重复3次。见表1。

图2 APPswe/PSΔE9转基因小鼠和对照小鼠脑组织中bcl-2蛋白表达情况

2.3 APPswe/PSΔE9转基因小鼠和对照小鼠脑组织中caspase-3和caspase-9的表达情况 与对照相比，3月龄和6月龄APPswe/PSΔE9小鼠中活化的caspase-9和caspase-3蛋白水平均升高(图3)。见表1。

表1 各组小鼠脑组织bcl-2、caspase-3、caspase-9的表达(n=12，s)

表1 各组小鼠脑组织bcl-2、caspase-3、caspase-9的表达(n=12，s)

月龄对照组 37.2±2.6 53.7±3.9 20.7±7.3 32.5±11.4 42.3±7组别 bcl-2 3月龄 6月龄caspase-3 3月龄 6月龄caspase-9 3月龄 6.4 52.6±6.3模型组 18.4±4.1 41.8±4.2 39.8±11.7 67.3±11.7 65.4±8.9 77.3±10.5

图3 APPswe/PSΔE9小鼠和正常对照小鼠中caspase-3和caspase-9的蛋白表达水平

3 讨论

AD是一种神经系统退行性疾病，是导致老年人痴呆的主要疾病，大约有50% ～60%的痴呆症患者都是由该病所导致的〔2〕。目前，AD的病因尚不明确，因此该病的治疗仍然十分困难。关于AD发病机制的研究，最初主要集中在APP、PS等单一的基因上，但是随着研究的不断深入和进展，人们逐渐发现AD的发生是一个非常复杂的过程，各种因素(包括异常的凋亡)都有可能参与其中。早在上世纪90年代，就已经有学者开始研究凋亡与AD的关系〔3，4〕，而且越来越多的研究表明，异常的凋亡可能在AD的发生过程中起到非常重要的作用。APP是在阿尔茨海默病发病机制中被研究最多的一个蛋白，但是它的功能目前仍不明确，新的研究发现〔5〕，其胞内结构域可以影响一些基因的表达，从而诱导神经元特异性凋亡，这也进一步提示我们凋亡在AD的发病机制中可能具有重要作用。

bcl-2是一种抗凋亡蛋白，它可以抑制caspase-3和caspase-9的活化，而后两者则是凋亡过程中至关重要的因子。本研究实验以APPswe/PSΔE9小鼠作为AD的模型，检测了其脑组织中bcl-2、caspase-3以及caspase-9的表达情况，结果显示，APPswe/PSΔE9小鼠脑组织中，bcl-2表达水平明显降低，而caspase-3和caspase-9水平则明显升高，提示在AD中可能存在异常高水平的凋亡。一些研究发现，bcl-2是AD的一个保护性因子〔6～9〕，我们的实验也在一定程度上间接支持了这一观点。此外还有研究发现，caspase活化以后可以导致AD中神经系统的退行性改变〔10〕。由此，我们可以看出bcl-2、caspase-3以及caspase-9等凋亡相关蛋白与AD的关系十分密切。我们的实验还发现，在3月龄APPswe/PSΔE9小鼠脑组织中就可以检测到这些凋亡相关蛋白的异常表达，这提示我们异常的凋亡可能在AD的早期就已经存在，这将有助于我们研究AD早期的发病机理，为其早期诊断早期治疗提供一定的帮助。

1 宗园媛，王晓映，王海林，等.APP/PS双转基因阿尔茨海默病小鼠模型的老年斑及行为学动态分析〔J〕.中国比较医学杂志，2008;18(9):8-12.

2 Blennow K，de Leon MJ，Zetterberg H.Alzheimer's disease〔J〕.Lancet，2006;368(9533):387-403.

3 LaFerla FM，Tinkle BT，Bieberich CJ，et al.The Alzheimer's A beta peptide induces neurodegeneration and apoptotic cell death in transgenic mice〔J〕.Nat Genet，1995;9(1):21-30.

4 Su JH，Anderson AJ，Cummings BJ，et al.Immunohistochemical evidence for apoptosis in Alzheimer's disease〔J〕.Neuroreport，1994;5(18):2529-33.

5 Ohkawara T，Nagase H，Koh CS，et al.The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis〔J〕.Gene，2011;475(1):1-9.

6 Saillé C，Marin P，Martinou JC，et al.Transgenic murine cortical neurons expressing human Bcl-2 exhibit increased resistance to amyloid beta-peptide neurotoxicity〔J〕.Neuroscience，1999;92(4):1455-63.

7 Song YS，Park HJ，Kim SY，et al.Protective role of Bcl-2 on beta-amyloidinduced cell death of differentiated PC12 cells:reduction of NF-kappaB and p38 MAP kinase activation〔J〕.Neurosci Res，2004;49(1):69-80.

8 Ferreiro E，Eufrásio A，Pereira C，et al.Bcl-2 overexpression protects against amyloid-beta and prion toxicity in GT1-7 neural cells〔J〕.J Alzheimers Dis，2007;12(3):223-8.

9 Rohn TT，Vyas V，Hernandez-Estrada T，et al.Lack of pathology in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease after overexpression of the anti-apoptotic protein Bcl-2〔J〕.J Neurosci，2008;28(12):3051-9.

10 de Calignon A，Spires-Jones TL，Hyman BT.Caspase activation precedes and leads to neurodegeneration in a murine model of Alzheimer's disease〔J〕.Med Sci(Paris)，2010;26(10):787-9.