张彩娥 陈 岚 任伟萍 梅爱华 邓云华＊

人ABCB6表达载体的构建及稳定表达细胞株A375的筛选

张彩娥1陈 岚2任伟萍2梅爱华2邓云华2＊

（1华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科，2皮肤科，武汉430030）

目的 构建表达载体pIRES2-Zs Green1-ABCB6，在转染的人黑素瘤细胞系株A375中筛选其稳定表达的细胞株。方法 抽取健康人外周血，分离外周血单个核细胞，提取总RNA，逆转录获取c DNA序列，加入特异性引物经PCR扩增获得ABCB6 c DNA双链，再经过B gl II、E co RI双酶切PCR产物及质粒载体pIRES2-Zs Green1，酶切产物经回收、T4 DNA连接酶连接，产物转化到大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆经菌落PCR鉴定、酶切鉴定和测序分析，以确定构建质粒正确。转染人黑素瘤细胞株A375，G418筛选稳定表达ABCB6的单克隆细胞株，应用荧光显微镜鉴定ABCB6蛋白的表达情况。结果pIRES2-Zs Green1-ABCB6质粒经菌落PCR、酶切、测序鉴定正确，经过G418筛选后获得稳定细胞株，在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蛋白在A375细胞中的表达。结论 表达载体pIRES2-Zs Green1-ABCB6构建正确，并成功筛选出稳定表达ABCB6的A375细胞株，为进一步研究ABCB6的生物学功能奠定了良好基础。

ABCB6；表达载体；转染；A375细胞

腺苷三磷酸结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette transporters，ABC转运蛋白）是一大类跨膜蛋白，利用水解ATP的能量对溶质中多种内、外源性生物分子进行跨膜转运，其转运的底物包括：糖、氨基酸、金属离子、多肽、蛋白质、细胞代谢产物和药物等。ABC转运蛋白广泛存在于真核和原核生物中，在人类基因组中迄今已鉴定出49个ABC转运蛋白超家族成员，分为 A-G 七个亚族［1-2］。ABCB家族基因仅存在于脊椎动物基因组中，人类基因组有11个成员，其中ABCB1是第一个被发现的人类ABC转运蛋白。……