成 羿 董学亮 王 佩 杭州市中医院 杭州 310007

传统中医药治疗骨骼肌损伤有独特的疗效。本实验观察我院自制活血止痛膏剂外敷治疗兔腓肠肌钝挫伤，并应用RT-PCR检测兔IIb型肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC）、I型胶原、III型胶原mRNA的表达，探讨活血止痛膏剂对骨骼肌修复的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验药物 活血止痛膏剂（主要药物:片姜黄、赤芍药等，由本院药剂科提炼制成膏剂，高剂量组药物浓度为临床人体使用药物浓度，中剂量组为高剂量组浓度的50%，低剂量组为高剂量组浓度的10%）。青鹏膏（药物组成：棘豆、亚大黄、铁棒锤、诃子、安息香、人工麝香等，西藏奇正藏药股份有限公司，准字号Z54020140）。

1.2 主要试剂 Trizol试剂（上海生工生物工程技术服务有限公司）。HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）。2×Taq MasterMix（含染料）酶（北京康为世纪生物科技有限公司）。100bp DNA Ladder Marker（TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司）。

1.3 实验动物 中国大白兔63只，平均体质量（2.5±0.2）kg，雌雄各半。由浙江中医药大学动物实验中心提供。饲养及取标本皆在该中心完成。实验动物合格证号：SCXK（浙）2008-0036。

1.4 实验方法 参照张静[1]造模方法，并稍加改进。将日本大耳白兔俯卧位固定在解剖台上，在双后肢褪毛，利用重力棒选定腓肠肌肌腹中段做为打击中心（距跟骨6.5cm处）。将打击棒放塑料管中，管下口垂直对准打击部位，重物自由落体下落导致一次打击伤，造成腓肠肌急性挫伤模型。60只造模成功。随机分为活血止痛膏高、中、低剂量组及青鹏膏对照组、外伤对照组，各12只。另取3只设为正常对照组。活血止痛膏各剂量治疗组和青鹏膏组于伤后第一天取相应膏剂外敷伤处，1天1次，每日更换。外伤对照组仅予纱布伤处包扎。各实验组分别在3、10、20、27天各处死兔子3只，取双侧腓肠肌标本，共6个。正常对照组3只一次性处死取标本。分别做RT-PCR检测内源性IIb型MHC、I型及III型胶原mRNA。

1.5 引物设计与合成 检索 NCB I GenBank数据库中IIb型MHC、I型胶原、III型胶原全长mRNA序列，应用Primer premier5.0软件设计出IIb型MHC、I型胶原、III型胶基因以及内参GAPDH基因的上下游引物序列。引物均由TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司合成，见表1。

表1 引物序列

1.6 统计学方法 实验数据输入计算机，用SPASS 17.0统计分析软件对完全随机设计多组计量资料进行分析，计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD方法。

2 实验结果

2.1 Ⅱb型MHC mRNA检测结果 伤后第3、10、20、27天各实验组Ⅱb型MHC mRNA与正常组比较，均有升高（P＜0.05）；伤后第3、10、20天活血止痛膏中、高剂量组及青鹏膏组高于外伤组、活血止痛膏低剂量组（P＜0.05）。伤后第10天各实验组Ⅱb型MHC mRNA均达到峰值；伤后第10、20天中剂量组Ⅱb型MHC mRNA表达量低于高剂量组与青鹏膏组（P＜0.05）。伤后第27天各实验组Ⅱb型MHC mRNA降至实验阶段最低，见表2、图1。

表2 各组Ⅱb型MHCmRNA含量比较（±s）

表2 各组Ⅱb型MHCmRNA含量比较（±s）

注：与正常组比较，☆P＜0.05；与外伤组比较，△P＜0.05；与低剂量组比较，○P＜0.05；与中剂量组比较，◆P＜0.05

组 别正常组外伤组低剂量组中剂量组高剂量组青鹏膏组n/个6 6 6 6 6 6 3天0.418±0.100 0.600±0.110☆0.608±0.118☆0.795±0.184☆△○0.812±0.062☆△○0.803±0.130☆△○10天0.418±0.100 0.752±0.140☆0.763±0.104☆0.939±0.108☆△○1.115±0.089☆△○◆1.122±0.229☆△○◆20天0.418±0.100 0.661±0.077☆0.639±0.113☆0.834±0.020☆△○1.012±0.129☆△○◆0.986±0.074☆△○◆27天0.418±0.100 0.618±0.118☆0.618±0.110☆0.666±0.084☆0.684±0.046☆0.682±0.100☆

注：上一排为目的条带，下一排为对应内参，从左到右泳道依次是：1为100bp DNA Ladder Marker；2为正常组；3～6为外伤对照组3天、10天、20天、27天，7～10为活血止痛膏剂高剂量组3天、10天、20天、27天；11～14为活血止痛膏剂中剂量组3天、10天、20天、27天；15～18为活血止痛膏剂低剂量组3天、10天、20天、27天。

2.2 Ⅰ型胶原mRNA表达 实验各组伤后第3天Ⅰ型胶原mRNA含量未见明显增高；且各组之间两两比较均无统计学意义（P＞0.05），伤后第10天Ⅰ型胶原mRNA各实验组都达到峰值；第10、20天各组表达量升高与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05），活血止痛膏中、高剂量组、青鹏膏剂组表达低于外伤组和低剂量组（P＜0.05）；中剂量组表达高于高剂量组和青鹏膏组（P＜0.05）。第27天各实验组Ⅰ型胶原mRNA含量较第20天明显降低，且趋于相同，但都高于正常组（P＜0.05），见表3、图2。

表3 各组Ⅰ型胶原mRNA含量比较（±s）

表3 各组Ⅰ型胶原mRNA含量比较（±s）

注：与正常组比较，☆P＜0.05；与外伤组比较，△P＜0.05；与低剂量组比较, ○P＜0.05；与中剂量组比较，◆P＜0.05

组 别正常组外伤组低剂量组中剂量组高剂量组青鹏膏组n/个6 6 6 6 6 6 3天0.421±0.260 0.596±0.260 0.588±0.066 0.448±0.082 0.403±0.045 0.472±0.090 10天0.421±0.260 1.216±0.121☆1.273±0.113☆0.934±0.185☆△○0.712±0.089☆△○◆0.702±0.086☆△○◆20天0.421±0.260 1.092±0.167☆1.064±0.175☆0.854±0.126☆△○0.618±0.064☆△○◆0.621±0.128☆△○◆27天0.421±0.260 0.802±0.138☆0.659±0.139☆0.684±0.115☆0.627±0.116☆0.630±0.110☆

2.3 Ⅲ型胶原mRNA表达 各组伤后第3天Ⅲ型胶原mRNA有明显增高，接近峰值，随着药物及浓度的不同，升高的幅度也不同。第10天达到峰值，但较第3天无明显差异，第20天较第10天下降。第3、10、20天各组内源性Ⅲ型胶原mRNA表达量高于正常组（P＜0.05）；活血止痛膏中、高剂量组、青鹏膏组表达量低于外伤组和低剂量组（P＜0.05）；中剂量组表达量高于高剂量组和青鹏膏组（P＜0.05）；高剂量组与青鹏膏剂组比较无统计学意义（P＞0.05）。第27天各实验组Ⅲ型胶原的mRNA含量高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4、图3。

表4 各组Ⅲ型胶原mRNA含量比较（±s）

表4 各组Ⅲ型胶原mRNA含量比较（±s）

注：与正常组比较，☆P＜0.05；与外伤组比较，△P＜0.05；与低剂量组比较，○P＜0.05；与中剂量组比较，◆P＜0.05

组 别正常组外伤组低剂量组中剂量组高剂量组青鹏组n/个6 6 6 6 6 6 3天0.504±0.099 1.314±0.129☆1.299±0.276☆0.980±0.261☆△○0.751±0.123☆△○◆0.749±0.123☆△○◆10天0.504±0.099 1.439±0.083☆1.459±0.161☆1.166±0.217☆△○0.805±0.122☆△○◆0.830±0.245☆△○◆20天0.504±0.099 1.337±0.102☆1.320±0.194☆1.072±0.173☆△○0.782±0.306☆△○◆0.794±0.265☆△○◆27天0.504±0.099 0.847±0.242☆0.847±0.254☆0.821±0.229☆0.778±0.273☆0.782±0.105☆

3 讨 论

中医认为，骨骼肌急性钝挫伤后，筋肉或伤、或断，络脉随之受伤，气血互阻，血肿形成引起疼痛和功能障碍，治疗以活血化瘀，行气通络，消肿止痛为主。“活血止痛膏剂”由片姜黄、赤芍药、马钱子等中药组成。片姜黄破血行气止痛，赤芍药活血散瘀，凉血清热均为君药；马钱子通经络，消结肿，止疼痛。诸药合用共奏化血破瘀，退肿止痛，凉血清热，预防瘀血化热的功效。中药治疗软组织损伤的机制包括：①抗渗出：在损伤早期减少组织出血，抑制炎症反应。②改善微循环：修复微循环系统，加强受损组织对丢失和渗出细胞的吸收，有利于肌纤维修复愈合。③镇痛解痉：通过镇痛作用减轻受损组织的疼痛反应，通过抗炎作用抑制损伤组织的局部炎性渗出、浸润，从而改善缺氧和代谢状态；通过解痉作用松弛僵硬的肌肉组织，从而改善肌肉纤维的扭曲和紊乱，促进损伤断裂的肌肉纤维接近或合拢以及减少纤维性疤痕的产生。④抑制胶原纤维合成：防止结缔组织过量增生，减少疤痕性愈合，增加肌细胞性修复。药理研究证明，姜黄素是一种新型的抗氧化剂，可阻止丙酮醛/赖氨酸诱导的氧化应激和DNA损害，并且可抑制丙酮醛诱导的人单核细胞凋亡和活性氧的产生[2]。姜黄素对急性、亚急性和慢性炎症具有抗炎作用。姜黄素对花生四烯酸代谢中的环氧合酶和脂氧合酶均有拮抗作用[3]。赤芍具有抗炎、镇痛作用、抗血小板凝聚作用。马钱子及其氮氧化物有改善微循环、增加血流、抗血栓形成及抑制血小板聚集作用，马钱子碱的剂量达到马钱子碱氮氧化合物和阿司匹林的一半时，即有与马钱子碱氮氧化合物和阿司匹林同样作用[4]。马钱子及其主要成分对整个中枢神经系统均有兴奋作用，且具有明显量效相关性，治疗剂量以中枢神经系统兴奋为主，同时具有非成瘾性镇痛、抑制变态反应性炎症、抗凝、促进循环等作用[5]。本实验通过观察活血止痛膏治疗急性骨骼肌钝挫伤后，骨骼肌组织局部的IIb型MHC、I型及III型胶原mRNA的表达的影响。结果表明高剂量活血止痛膏能够抑制胶原合成，促进骨骼肌蛋白合成，其作用与青鹏膏相当。

［1］张静，赵斌.按摩对兔骨骼肌挫伤后修复作用的研究［D］.河北师范大学，2003.

［2］ChanWH，Wu HJ.Protective effectsof curcumin onmethylglyoxal-induced Oxidative DNA damage and cell injury in human mononuclear cells［J］.Acta Pharmacol Sin，2006，27（9）：1192-1198.

［3］Hammamieh R，Sumaida D，Zhang X，et al.Control of the growth of human breast cancer cells in culture bymanipulation of arachidonate metabolism［J］.BMC Cancer，2007，7:138.

［4］周建英，卞慧敏，马聘，等.马钱子碱和马钱子碱氮氧化物抗血小板聚集及抗血栓形成作用的研究［J］.江苏中医，1998，19（4）:41.

［5］胡锡琴，郭翠华.马钱子研究述要［J］.陕西中医，2005，26（11）:1229.