宋 宇，黄 勇

（1.四川省乐山市市中区畜牧食品局，四川 乐山 614000；2.四川农业大学动物医学院，四川 雅安 625014）

魏氏梭菌病是危害养兔业的重要疾病，α毒素是该菌的主要致病因子且具有较好的免疫原性。目前关于魏氏梭菌α毒素抗体的间接ELISA检测方法报道较少，本文在对家兔魏氏梭菌分离鉴定的基础上，对该菌主要的毒素——α毒素进行基因扩增、克隆和表达，并以表达产物为抗原，建立检测抗α毒素抗体的间接ELISA方法，为家兔魏氏梭菌疫苗的评价提供实验室检测手段。

1 材料

1.1 病料来源 四川省某养殖场饲养的300只家兔，突然发病，发病兔为35～115日龄，以急性腹泻、排黑色水样或带血的胶冻样粪便、盲肠浆膜出血斑和胃黏膜出血、溃疡为主要特征，并出现死亡。

1.2 试剂 革兰氏染色液、PCR反应试剂、DNA Marker、T4DNA 连接酶、溶菌酶、EcoRI、HindⅢ，均购自大连宝生物工程公司；药敏试纸购自杭州微生物试剂有限公司；低分子质量蛋白Marker购自博瑞克公司；其他常规试剂均为国内生产；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG购自博瑞克公司；牛血清蛋白（BSA）为美国Sigma公司产品。

1.3 载体 PMD19-T载体购自大连宝生物工程公司；大肠杆菌感受态细胞 E.coli DH5α、BL21（DE3）、表达载体PET-32a（+），由川农大动物学院实验室保存。

1.4 仪器 恒温摇床、厌氧培养箱、显微镜、PCR仪、核酸电泳槽、台式离心机、超净工作台、BIO RAD凝胶成像系统，mini涡旋振荡器等，恒温水浴锅（±0.5℃），台式冷冻离心机、96孔ELISA酶标板，均购自Bio Rad公司。

2 方法

2.1 染色镜检 将无菌采取的病料触片，进行革兰氏染色、镜检。

2.2 细菌分离培养 无菌操作,取病死兔肝脏病料划线接种于鲜血琼脂平板上，37℃厌氧培养24～48h，观察菌落特征。……