姚慕崑，刘 玮，任萍萍，吴希美

(1.浙江省立同德医院，浙江 杭 州 310012;2.浙江大学医学院临床一系浙江，3.浙江大学医学院药理学系，杭州 310058)

溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)在某些肿瘤的转移中具有一定的作用［1］，如LPA与其受体可促进乳腺癌向骨的转移［2］，同时其抑制剂可有效的逆转肿瘤细胞的迁移［3］，但目前对LPA促进肿瘤转移的机制还不清楚，因此本文采用LPA处理He-La-S3人宫颈癌细胞，观察其对HeLa-S3细胞的迁移能力以及胞内ROS水平的影响，并进行相关机制的探讨。

1 材料与方法

1.1 试剂 HeLa S3人宫颈癌细胞(美国ATCC);二甲亚砜(DMSO)、AMD3100、溶血磷脂酸、牛血清白蛋白(BSA)、TritonX-100、LY294002、NAC(美国Sigma公司);HeLa S3专用培养基(美国biohermes公司);胰蛋白酶(美国Gibco公司);GAPDH、辣根过氧化物酶(HRP)标记鼠二抗、兔二抗单克隆抗体(美国 SANTA CRUZ公司);Akt(lot 9272)、P-Akt(Ser473，lot 9271)、PAK1(lot 2602)、P-PAK1(Thr423，lot 2601)多克隆抗体(美国 Cell Sigaling Technology公司)。

1.2 细胞传代培养 将HeLa S3细胞接种于60 ml的细胞培养瓶中，用HeLa S3专用培养基进行培养。培养2～3 d后，待细胞生长为致密单层时，移除培养基，用PBS清洗细胞3次，并采用0.25%胰蛋白酶(37℃预热)消化细胞1 min，至倒置显微镜观察成圆形时，加入少量含血清的HeLa S3专用培养基终止整个消化过程，室温下离心(1 500 r·min－1×5 min)，弃上清，收集细胞沉淀。并向沉淀中加入专用培养基，按照5×108·L－1的密度将HeLa S3细胞接种到培养瓶中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中进行培养。

1.3 细胞迁移实验 收集对数期的HeLa S3细胞，经胰酶消化处理后，以5×105的细胞密度接种到96孔培养板中，使用专用培养基培养24 h(含血清)，使用移液器吸头沿培养板底部作简单“一”字形1 mm宽的人工划痕，并采用倒置显微镜观察并拍摄划痕边缘区域及相对距离;对细胞进行药物处理12 h后，并通过比较处理前后划痕边缘相对距离的差值来测定迁移能力。……