张显忠，郭爱军，廉立慧，姜红霞，史仁玖

(1.泰山医学院生物科学学院，山东泰安 271016;2.泰安市中心医院放射科，山东泰安 271000)

肝细胞癌是我国常见的恶性肿瘤之一，死亡率较高，发生发展受细胞内多条信号传导通路的精密调控［1－2］。磷脂酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K)信号通路参与细胞的增殖、凋亡和分化等过程，在肿瘤的发生发展中起着重要的作用［3－4］。BEZ235是磷酸肌醇 3 激酶(PI3K)和其下游因子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的双重靶向抑制剂，表现出良好的抑制多种实体瘤活性［5－7］。本研究以肝癌细胞

HepG2为实验材料，检测BEZ235的体外抗癌活性及与阿霉素(doxorubicin hydrochloride，DOX，adriamycin，ADM)协同抑癌作用，为肝细胞癌的临床治疗提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 BEZ购自 Selleck Chemicals(Houston，TX，USA);RPMI 1640 培养基购自 Gibco(BRL，USA);胎牛血清购自 Lanzhou National Hy-Clone(Lan zhou，China);MTT购自 Genview(Houston，TX，USA);propidium iodine(PI)购自 Sigma;Annexin V-FITC购自南京凯基生物有限公司;ECL试剂盒购自 Thermo Scientific Pierce(Rockford，IL，USA)。Akt抗体、p-Akt抗体和 β-catenin抗体购自Cell Signaling;β-actin抗体购自Sigma;cyclinB1抗体和cyclinD1抗体购自Santa cruz;二抗均购自北京中杉金桥;DOX购自深圳万乐药业。

1.2 细胞株 人肝癌细胞株HepG2购自上海中科院细胞库。HepG2细胞于37℃和5%CO2条件下用RPMI 1640培养基培养，含有10%胎牛血清(兰州民海)、100 U·L－1青霉素和 100 μg·L－1硫酸链霉素。

1.3 MTT法测定细胞活力 胰酶消化HepG2细胞后接种于96孔板中，加入不同剂量的BEZ235继续培养，对照组加入PBS;终止培养前4 h加20 μl(5 g·L－1)的MTT于各个孔中，然后吸去培养液，加入150 μl的DMSO后室温振荡10 min;490 nm波长下测定各孔的A值，以同样的方法测6个平行孔，对结果进行统计分析。

1.4 流式细胞术检测细胞周期与凋亡 细胞用BEZ235处理后，胰酶消化并制备细胞悬液;加入75%的冷无水乙醇4℃固定18 h后用PBS洗2次，加入终浓度为50 mg·L－1的 RNase A，37℃ 30 min，加入终浓度为 50 mg·L－1的 PI，4℃闭光染色 20 min后上机检测。……