宋京城，金小花，蔡健

（苏州农业职业技术学院食品系，江苏 苏州 215008）

碳源对β-葡萄糖苷酶合成的影响研究

宋京城，金小花，蔡健

（苏州农业职业技术学院食品系，江苏 苏州 215008）

以黑曲霉（AspergiLLus niger NL－1）为产酶菌种，采用摇瓶发酵法，研究不同碳源对β－葡萄糖苷酶合成的影响。以水杨素为底物，以单位时间内催化水解水杨素产生葡萄糖的量表示酶活单位，测定酶活力。结果表明，麸皮为最佳的碳源，适宜的使用量为4%（质量分数）。以纯淀粉、微晶纤维素、葡萄糖、蔗糖、纤维二糖等为碳源酶活力很低，或不产酶。以麸皮为底物的最佳产酶时间为5 d，β-葡萄糖苷酶活力达到98.02 nkat/mL。纤维二糖对麸皮为碳源产β-葡萄糖苷酶无诱导作用。

β-葡萄糖苷酶；碳源；黑曲霉NL-1

纤维素酶酶系的3个组分分别为内切-β-1，4-葡聚糖酶（Endoglucanase，EC 3.2.1.4），即C1酶；外切－β－1，4－葡聚糖酶（Cellobiohydrolase，EC 3.2.1.91），即Cx酶；β－葡萄糖苷酶（β－Glueosidase，EC3.2.1.21）。3种组分协同作用能催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖。其中β-葡萄糖苷酶可以降解纤维素（如秸秆中）的纤维二糖生成葡萄糖，缺乏β-葡萄糖苷酶将导致酶水解得率下降，并严重影响C1和Cx酶的酶促反应[1]。β-葡萄糖苷酶在饲料、酒精、纺织品和保健食品等领域具有巨大的市场潜力，是酶制剂工业中的一个新的增长点。目前用于生产纤维素酶类的微生物大多属于丝状真菌，研究较多的有木霉属、曲霉属、根霉属和漆斑霉属，其中曲霉是公认产纤维素酶类最高的菌种之一[2-4]。本实验以不同碳源为培养基，对黑曲霉NL-1产生β-葡萄糖苷酶进行研究，为生产利用纤维素酶提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种和主要试剂、仪器

黑曲霉NL-1：由南京林业大学生物工程系菌种保藏室提供。

水杨素0.1%：国药集团北京化学试剂公司；考马斯亮蓝G-250：上海科端生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯或其配制，722s型可见分光光度计、SHZ-C型摇床：上海机密科学仪器有限公司；电热恒温水浴锅：DK-98-1型，天津泰斯特仪器有限公司。

1.1.2 培养基

斜面培养基：马铃薯蔗糖琼脂培养基，供保存和活化菌种用。

产酶发酵基础培养基：（NH4）2SO40.4%，KH2PO40.3%，CaCl20.05%，MgSO40.05%，FeSO40.005%，ZnCl20.00014%，吐温-802滴，pH4.8，分装于容积为250 mL的三角瓶中（每瓶100 mL），121℃灭菌30 min。在此培养基中分别加入不同碳源时则为实验用的不同碳源的“发酵产酶培养基”。

1.2 方法

1.2.1 菌种制作

以无菌操作将供试菌种移入斜面培养基中，置28℃恒温培养，待斜面长满孢子后用无菌水制成含量为4×106个/mL孢子悬液。

1.2.2 摇瓶发酵

将制备好的孢子悬液接种于制备好的“产酶发酵培养基”中，接种量为2%（体积分数）。置（35±1）℃恒温振荡发酵，转速150 r/min。

1.2.3 β-葡萄糖苷酶活力测定

以水杨素为底物，定义在最适反应条件下每分钟催化水解水杨素产生1μmol葡萄糖的酶量为1个酶活单位（U）。1 U=16.67×10-9kat=16.67 nkat。

空白管中加1.5 mL 1 mol/L柠檬酸缓冲液，0.5 mL 1%水杨素。其他样品管中加1.3 mL 1 mol/L柠檬酸缓冲液，0.5 mL 1%水杨素，0.2 mL酶液。在60℃水浴保温30 min。取出，加5 mL DNS（3，5-二硝基水杨酸溶液），煮沸5 min，定容至25 mL，用分光光度计在540 nm下进行比色测定。

1.2.4 总还原糖浓度的测定

采用DNS（3，5－二硝基水杨酸溶液）法[5]。

1.2.5 可溶性蛋白质的测定

采用改良的Bradford法测定[5]。

1.2.6 碳源的优化试验

分别选用麸皮、纯淀粉、微晶纤维素、葡萄糖、蔗糖、纤维二糖等6种物质作为碳源，加入到“产酶发酵基础培养基”中，添加量均分别为4%（质量分数），制备成为“产酶发酵培养基”。按“1.2.2”接种发酵，分别在第2、3天取样，测其pH、蛋白含量、还原糖以及β-葡萄糖苷酶酶活。

1.2.7 培养时间对产酶的影响试验

“产酶发酵基础培养基”中以5%（质量分数）麸皮作为碳源,按“1.2.2”接种发酵，分别于发酵的第2、3、4、5、6天取样测其pH、蛋白质含量、还原糖及β-葡萄糖苷酶酶活。

1.2.8 不同浓度碳源对产酶的影响试验

1.2.8.1 不同浓度的麸皮对产酶的影响

在“产酶发酵基础培养基”中分别加入1%、2%、3%、4%、5%（质量分数）麸皮作为碳源进行发酵产酶比较试验，按“1.2.2”接种发酵，分别在第2、3、4天取样，测定其蛋白质含量、还原糖量、酶活力。

1.2.8.2 不同浓度的淀粉对产酶的影响

在“产酶发酵基础培养基”中分别加入1%、2%、3%、4%、5%（质量分数）纯淀粉作为碳源进行发酵产酶比较试验,按“1.2.2”接种发酵，分别在第1、2、4天取样，测定其有酶无底和有酶有底的C值。

1.2.8.3 纤维二糖对β-葡萄糖苷酶合成的影响

在“产酶发酵基础培养基”中以4%的麸皮作为碳源，同时分别加入0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%（质量分数）的纤维二糖进行发酵产酶比较试验，按“1.2.2”接种发酵，分别在第3、4天取样，测定其pH、蛋白质含量、酶活力。

2 结果与分析

2.1 碳源的优化试验结果

碳源的优化试验结果如表1、表2所示。

表 1 第2天几种不同碳源的产酶效果Table 1 The effect of several different carbon sources 2nd days

表 2 第3天几种不同碳源产酶效果Table 2 The effect of several different carbon sources 3th days

从表1、2可以看出，以麸皮作碳源时产酶的滤纸酶活最高，达到62.35 nkat/mL，而其他以纯淀粉、微晶纤维素、葡萄糖、蔗糖、纤维二糖作为碳源的基本上不产酶或酶活很低。麸皮为碳源时还原糖的利用率较高，第2天为3.53 mg/mL，第3天则迅速下降到0.67 mg/mL。

在培养的第2天，由于菌丝体的快速繁殖使得麸皮培养基已经变得很黏稠，并可见直径约为1 mm左右的菌丝体小球；分别添加其它不同碳源的培养基也有同样的现象：培养基的颜色均与接种前基本相同。培养至第3天时麸皮培养基更加黏稠，菌丝体小球已溶解不能见；微晶纤维素培养基的菌丝体球少且很小，培养基颜色变为黄绿色；其他培养基中的菌丝体小球均变大达3 mm～4 mm。

2.2 培养时间对产酶的影响试验结果

培养时间对产酶的影响试验结果如图1所示。

由图1可知，从培养的第2天开始酶活不断增加，到第5天时达到最高值98.02 nkat/mL，第6天酶活出现下降。同时可以直观地看出蛋白质的消长曲线和酶活曲线的走向大致相同；pH的变化随着培养时间的增加而缓慢减小，但在第5天后略有增加，这便成了第6天酶活下降的原因之一。

培养基中还原糖从第2天的3.57 mg/mL降到第3天的1.87 mg/mL，此阶段消耗的碳源主要用于菌丝体的增殖；第3、4天是黑曲霉合成β-葡萄糖苷酶的主要阶段，在这一阶段，黑曲霉仅需少量葡萄糖满足自身的新陈代谢，在产酶末期几乎不再消耗葡萄糖[6]。

2.3 不同浓度碳源对产酶的影响试验结果

2.3.1 不同浓度的麸皮对产酶的影响结果

不同浓度的麸皮对产酶的影响结果如图2所示。

从图2可看出，第4天，培养基中麸皮浓度为5%时，酶活最高达92.85 nkat/mL。但与麸皮浓度为4%的87.68 nkat/mL比较相差甚小。麸皮浓度为1%、2%、3%时第4天酶活仍都很低，最高值为47.68 nkat/mL，最小为5.67 nkat/mL，这说明碳源浓度过低对产酶非常不利[7]。

麸皮浓度为1%、2%、3%时培养基中还原糖浓度始终维持在较低的水平；而麸皮浓度为4%、5%时还原糖的浓度则相对较高，在第2天分别为3.59 mg/mL和4.86 mg/mL。

2.3.2 不同浓度的淀粉对产酶的影响结果

不同浓度的淀粉对产酶的影响结果如表3所示。

由表3中第1、2、4天的有酶无底和有酶有底的C值的比较可以看出，不同淀粉浓度下有酶无底和有酶有底的值非常接近，这表明纯淀粉做碳源时，发酵结果并不产酶或者产酶量很少。从第1天到第4天pH下降非常剧烈，也许会导致所产酶失活[8]。所以纯淀粉不适宜作本实验菌株产β-葡萄糖苷酶的碳源。

2.3.3 纤维二糖对β-葡萄糖苷酶合成的影响结果

纤维二糖对β-葡萄糖苷酶合成的影响结果如表4所示。

表 3 淀粉浓度对产酶的影响Table 3 The comparison of different concentration starch on enzyme production

表 4 不同浓度纤维二糖对产酶的影响Table 4 The effect of different cellobiose concentration on the enzyme production

由表4中可知，第3天的酶活的变化均在93.52 nkat/mL左右，第4天的酶活的变化均在128.03 nkat/mL左右；可见有无纤维二糖及其添加量多少对酶活的大小并无影响，pH则随着纤维二糖浓度的增加逐步下降，蛋白质的变化不明显。

3 结论

碳源的种类对被试黑曲霉菌株产酶酶活的高低有着非常重要的影响，以麸皮作碳源时酶活最高，而以纯淀粉、微晶纤维素、葡萄糖、蔗糖、纤维二糖作为碳源时的基本上不产酶或酶活很低。以5%的麸皮作为碳源，第5天时酶活达到最高（98.02 nkat/mL）。麸皮浓度为5%和4%是产酶比较相差甚小，从经济效益上来讲应选用4%麸皮，碳源浓度过低不利于产酶。以麸皮作培养基加入不同浓度的纤维二糖作为诱导物，发现纤维二糖或者添加纤维二糖的多少对酶活的大小并无影响，而纯的纤维二糖基本上不产酶。

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Study on Carbon Source of β-Glucosidase by AspergiLLus niger

SONG Jing-cheng， JIN Xiao-hua，CAI Jian
（Department of Food，Suzhou Polytechnic Institute of Agriculture，Suzhou 215008，Jiangsu，China）

Effects of carbon sources on the biosynthesis of β－Glucosidase by AspergiLLus niger NL－1.We investigated Salicin as the substrate was used to indicate activity in unit time.The results showed that bran was the best carbon source for β－Glucosidase production among the studied carbon sources，and it's preferable concentration was 4%.Starch，microcrystalline cellulose，glucose，sucrose，cellobiose，etc.were not carbon sources for β－Glucosidase production.The best time for fermentation is 5 days，in the case，the highest activity of β－Glucosidase 98.02 nkat was obtained.Cellobiose as bran carbonsource hadn't been inducing effect.

β－Glucosidase；carbonsource；Aspergillus niger NL－1

江苏省高校自然科学研究计划项目（05KJD150195）

宋京城（1980—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：食品与生物技术。

2011-08-13