山西 朱虹

细胞核蛋白是指在细胞质内合成,然后运输到核内起作用的一类蛋白质。核蛋白的研究在动、植物病害的防治及临床医学上有十分重要意义。在核蛋白提取的过程中，为了防止蛋白质降解和损耗，提取的步骤越少越好。我们使用各种不同的方法来摸索细胞核抽提实验的最佳方法和条件。最后我们根据2004年清华大学出版社出版，由刘进元翻译的《转录因子实用技术》一书，优化HeLa细胞核提取物的制备的方法，制备家蚕细胞核提取物。由于家蚕在5龄3天时期体内蛋白量表达最高，所以我们选择这个时期的家蚕幼虫作为材料提取细胞核蛋白。

一、家蚕脂肪体细胞核蛋白抽提方法的建立

1.实验材料

家蚕基因库5龄3天大造蚕品种雄性脂肪体。

2.所用试剂

3.所用仪器

（1）20mLDounce带较松研钵的玻璃匀浆器

（2）截留分子质量为12000～14000Da的透析袋

（3）透析夹

4.实验方法

（1）取家蚕5龄3天脂肪体，加入5倍体积的缓冲液A，用匀浆器匀浆30-40下，5000 rpm离心10min。

（2）冰育10min,5000 rpm离心10min。

（3）弃去上清，用3倍体积的缓冲液A重悬浮，用匀浆器匀浆20下左右。5000 rpm离心10min以沉降细胞核。

（4）取出上清（细胞质蛋白），重悬沉降细胞核于1mL缓冲液C中，测量总体积，加NaCl至终浓度300mmol/L，采用上下颠倒方式充分混合。

（5）冰浴30min，在4℃下以15000 rpm离心20min。

（6）用500mL缓冲液C透析，第一次透析过夜，第二次透析4 h。冷冻干燥后稀释，把溶液分装，取一管用Bradford方法测定蛋白浓度,其他于-80℃储存备用。

二、家蚕脂肪体细胞核蛋白的检测

（一）Brad ford方法测定蛋白浓度

1.所用试剂：

试剂A：考马斯亮蓝G-250原液（称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 95%的乙醇，加入100mL 85%（W/V）磷酸。……