袁海峰，李 玺，权乾坤，王宁宁，刘 颖，李 明

（西安交通大学医学院第二附属医院，西安710004）

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的病理改变是脑内β淀粉样肽（β－Amyloid，Aβ）沉积和清除失衡。研究发现抗脑内Aβ聚集和沉积治疗不仅可以消除脑内Aβ沉积，而且有缓解认知障碍的作用，成为当前AD治疗研究的热点[1]。最近研究表明[2]，低密度脂蛋白受体相关蛋白（LDL receptor－related protein LRP）除了可以通过内吞作用清除Aβ外，还可以介导脑内Aβ经血脑屏障的外流转运入血从而清除Aβ。复方中药脑尔康的前期研究结果显示该药具有抑制AD模型小鼠大脑皮层和海马胆碱酯酶活性[3]、改善AD模型小鼠学习记忆的作用[4]，初步阐明了该方抗痴呆的作用机理。本实验拟研究其对LRP的表达的影响，旨在探讨其干预Aβ沉淀的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 7周龄健康雄性SD大鼠48只，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，体质量（220±10）g，合格证号SCXH（陕）2007－001。将其随机分为6组：空白组、模型组、吡拉西坦组及脑尔康大、中、小剂量组，每组8只。

1.1.2 实验仪器 转轮式石蜡切片机（德国Leica公司，型号为RM2135）；光学显微镜（日本Olympus公司，型号为BH22）；图像信号采集分析系统（德国Leica公司，型号为Qwin550CW）；大鼠脑立体定位仪（日本太阳株式会社，型号为SN－3）。

1.1.3 药物与试剂 复方中药脑尔康由人参10g，川芎10g，生地15g，益智仁12g，冰片1g等组成，生药饮片由西安交通大学医学院第二附属医院中药房提供，按传统方法水煎，水浴浓缩至含生药10g·mL－1，4℃保存备用。吡拉西坦，宜昌人福药业有限责任公司生产，批准文号为国药准字H42022130，生理盐水配置成浓度0.25g·mL－1的溶液，4℃保存备用。Aβ1－42兔抗鼠多克隆抗体、LRP兔抗鼠多克隆抗体、免疫组化试剂盒，购于北京博奥森生物技术有限公司。Aβ1－42溶于无菌生理盐水（2μg·μL－1），用前37℃孵育7d，使其成为凝聚态。多聚赖氨酸及DAB显色剂购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的建立 选择大鼠双侧海马CA1区为注射靶区（前囟向后3.0mm，中线旁开2.2mm，硬脑膜下2.8mm），一次性注射凝聚态Aβ1－42制备AD模型[5]。大鼠经10%水合氯醛（3.5mL·kg－1）腹腔注射麻醉，固定于大鼠立体定位仪，参照包新民[6]等 《大鼠脑立体定向图谱》，用牙科钻钻开颅骨，微量注射器自硬脑膜垂直进针2.8mm，缓慢注射10min，留针5min，每侧注射5μL，模型组、吡拉西坦组及脑尔康大、中、小剂量组大鼠注射Aβ1－42（2μg·μL－1），空白组大鼠注射等体积生理盐水。术后局部撒复方新诺明药粉防止感染，缝合头皮，每只大鼠肌肉注射青霉素4万U，连续3d。

1.2.2 行为学测试 采用Y型电迷宫箱进行行为学测试[7]。Y型电迷宫为三等分辐射式反射箱，反射箱三个臂的顶端有信号灯，信号灯亮时此臂安全无电。大鼠学习、记忆成绩分别以其连续10次测试中有9次（9/10）正确反应时所需的电击次数表示。安全区以无规则次序变换，以训练大鼠辨别灯光刺激及安全方位的能力。训练时将大鼠放入起步区，通过电刺激控制器电击动物足部，电击电压为30V。大鼠遭受电击后，若直接逃至安全区为正确反应，反之为错误反应。记录大鼠达到连续10次电击中9次（9/10）正确反应前所经受的电击次数作为学习成绩。24h后测试记忆成绩，仍以达到（9/10）正确反应前所经受的电击次数表示。行为学测试在造模3d后及药物干预28d后各进行一次。

1.2.3 给药方法 各组给药按照 “实验动物与人按体表面积等计量换算比例”换算[8]，计算出大鼠脑尔康大、中、小剂量组分别为60、30、15g·kg－1·d－1；吡拉西坦剂量为：0.375g·kg－1·d－1。空白组、模型组灌等体积生理盐水，第一次行为学测试后开始灌胃，每天灌胃1次，上午10点左右进行，连续28d。

1.2.4 组织标本制备 最后一次学习记忆成绩测试30min后，10%水合氯醛（3.5mL·kg－1）腹腔麻醉，开胸暴露心脏，经左心室插管至主动脉，剪开右心耳，快速灌注生理盐水，至肝脏变白改灌注液为4%多聚甲醛，灌注时间约60min，见大鼠尾巴、四肢僵硬视为满意，然后开颅取脑，标记前囟点，在前囟后2.0mm处、前囟后4.0mm处分别用刀片垂直切下，即以海马注射点（前囟后3.0mm）为界前后1.0mm冠状垂直切取，将切下的中间脑组织浸入4%多聚甲醛，置于4℃冰箱48h，其余脑组织弃去，后流水冲洗24h，然后脱水、透明、浸蜡、包埋。参照包新民[6]等 《大鼠脑立体定向图谱》，每个标本作冠状切片，在前囟后3.0mm位置连续切片3张，片厚4μm。

1.2.5 海马Aβ1－42、LRP的检测 采用免疫组织化学法（SP法）分别检测各组大鼠海马CA1、CA3和齿状回Aβ1－42、LRP的阳性表达情况，Aβ1－42、LRP的一抗浓度分别为1∶1000、1∶500，染色步骤按说明书进行，PBS代替一抗作阴性对照。采用图象处理与分析系统对阳性表达进行灰度分析，每张切片同一区域中，随机选取4个视野，检测面积相同，取其平均值作为该切片目标区域的平均灰度值。

1.3 统计学方法

使用SPSS 11.0统计软件处理，计量资料数据用（±s）表示，方差齐性检验采用Levene检验，正态性检验采用Shapiro－wilk检验。符合方差分析条件的数据多组均数间比较采用单因素方差分析，两两均数间比较采用LSD－t检验；不符合方差分析条件的数据，多组均数间比较采用Kruskal－Wallis秩和检验，两两均数间比较采用Wilcoxon秩和检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Aβ1－42对大鼠一般状态的影响

大鼠术后24h精神状态均呈现萎靡不振，活动减少，饮食差，对刺激的反应减弱。空白组大鼠恢复迅速，模型组恢复相对缓慢。

2.2 脑尔康对AD模型大鼠学习记忆能力的影响

各用药组的学习与记忆能力比模型组明显提高（P＜0.01）；脑尔康大剂量组作用优于西药组（P＜0.05），脑尔康三个剂量组之间比较，大剂量组学习能力优于中、小剂量组（P＜0.05或P＜0.01），三个剂量组之间记忆能力无明显差别（P＞0.05），见表1。

表1 脑尔康对AD模型大鼠学习记忆能力的影响（x±s，灰度值）

2.3 脑尔康AD模型大鼠海马Aβ1－42表达的影响

模型组海马区Aβ1－42阳性反应物质比空白组明显增多（P＜0.01）；各用药组Aβ1－42表达比模型组明显减少（P＜0.01）；在海马DG区，脑尔康大剂量组作用优于吡拉西坦组（P＜0.05），脑尔康三个剂量组比较差异显著（P＜0.05或P＜0.01），以大剂量组Aβ1－42的表达最少，见表2、图1。

表2 脑尔康对AD模型大鼠海马Aβ1－42表达的影响（±s，灰度值）

表2 脑尔康对AD模型大鼠海马Aβ1－42表达的影响（±s，灰度值）

注：与空白组比较＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与模型组比较▲▲P＜0.01；与吡拉西坦组比较■P＜0.05，■■P＜0.01；与脑尔康小剂量组比较□P＜0.05，□□P＜0.01；与脑尔康中剂量组比较◇P＜0.05。

组别 n CA1 CA3 DG空白组8 177.43±5.13 167.43±1.65 165.66±3.01模型组 7 158.18±2.98＊＊ 157.70±2.65＊＊ 160.24±2.43＊＊吡拉西坦组 8 167.35±1.52＊＊▲▲ 165.70±1.67＊＊▲▲ 163.63±1.44＊＊▲▲脑尔康小剂量组 8 160.71±2.04＊＊▲▲■■ 159.12±2.12＊＊▲▲■■ 163.47±1.80＊＊▲▲■■脑尔康中剂量组 8 162.32±1.61＊＊▲▲□ 159.12±1.67＊＊▲▲□ 167.16±1.48＊＊▲▲□__脑尔康大剂量组 8 168.34±1.16▲▲□□◇ 167.62±1.71＊▲▲□□◇ 165.23±1.73▲▲■□□◇

图1 各组大鼠海马Aβ1－42表达（普通光学显微镜，×400）

2.4 脑尔康AD模型大鼠海马LRP表达的影响

模型组与空白组比较，各海马区阳性反应物质表达无明显差异（P＞0.05）；各用药组LRP表达比模型组增多（P＜0.01或P＜0.05）；中药三个剂量组之间比较存在差异（P＜0.05或P＜0.01），以大剂量组LRP的表达最多，见表3、图2。

表3 脑尔康对AD模型大鼠海马LRP表达的影响（±s，灰度值）

表3 脑尔康对AD模型大鼠海马LRP表达的影响（±s，灰度值）

注：与空白组比较＊P＜0.05；与模型组比较▲P＜0.05；▲▲P＜0.01；与吡拉西坦组比较■P＜0.05，■■P＜0.01；与脑尔康小剂量组比较□P＜0.05，□□P＜0.01；与脑尔康中组之间比较◇P＜0.05。

CA1 CA3 DG空白组组别 n 8 164.52±2.61 165.72±1.91 167.38±1.23模型组 7 168.71±1.21 168.70±1.31 168.78±1.26吡拉西坦组 8 166.87±1.47＊▲ 163.81±1.56＊▲▲ 162.92±2.18＊▲▲脑尔康小剂量组 8 168.82±1.47■ 167.50±1.73＊■■ 166.33±1.57▲■■脑尔康中剂量组 8 165.16±1.56＊▲▲□ 162.13±1.28＊▲▲ 163.29±1.17＊▲▲■□脑尔康大剂量组 8 162.69±1.22＊▲▲□□◇ 162.12±2.26＊▲▲□□ 161.09±3.15＊▲▲□□◇

图2 各组大鼠海马LRP表达（普通光学显微镜，×400）

3 讨 论

阿尔茨海默病的三大特征性病理改变为：老年斑、神经纤维缠结和神经元大量缺失，细胞外沉积的老年斑是AD的一个关键病理特征，主要由大脑皮层及脑区细胞间隙的Aβ沉积而成[9]，主要构成成分是Aβ1－40和 Aβ1－42

[10]。国外学者研究认为脑内Aβ聚集和沉淀促发炎症级联反应、神经元纤维缠结、轴突损伤和突触丢失，最终导致神经元凋亡和发生痴呆[11]。从Aβ的产生、聚集和沉积再到老年斑的形成是AD的重要病理环节。因此，以Aβ为研究靶标，降低Aβ的产生、抑制Aβ的聚集和沉积是预防和治疗AD的有效措施，但目前抗Aβ治疗还没有上市的药物。复方中药具有活性成分多样、作用靶点广泛、副作用小的优势，因此研究复方中药治疗AD具有良好的应用前景，已成为临床治疗老年性痴呆的重要手段。脑尔康是复方中药制剂，由人参、川芎、生地、益智仁、冰片等组成，具有益智健脑、活血化瘀、补肾生髓、调养心神之功效。本实验将凝聚态Aβ1－42一次性注入大鼠海马CA1区模拟AD病理变化，结果显示模型组海马区Aβ1－42的表达较空白组明显增加（P＜0.01），并且大鼠学习记忆功能明显受损，成功制备AD模型，利用脑尔康对AD模型大鼠灌胃干预28d后，和模型组比较，脑尔康各剂量组海马区Aβ1－42的表达均有明显的下调（P＜0.01），学习和记忆能力明显改善（P＜0.01），这说明脑尔康能降低AD模型大鼠海马区Aβ1－42的含量，并能改善其学习记忆能力。

LRP主要参与脂蛋白代谢和细胞内信号转导。研究发现，脑内的LRP主要由神经元产生，载脂蛋白E、α2巨球蛋白和LRP基因与晚发性AD相关[12]，载脂蛋白E、α2巨球蛋白都是LRP的配体，由星形胶质细胞产生，胞外可溶性Aβ与载脂蛋白E、α2巨球蛋白形成复合物，再由LRP介导内吞清除[2]。另外，LRP也介导脑内Aβ经血脑屏障的外流转运入血而清除，LRP基因缺失的AD动物脑内Aβ成倍增加[13]，随年龄增长，LRP表达渐进性下降，AD患者尤其明显，适当上调LRP的表达，可能促进脑内Aβ的清除。本实验结果表明脑尔康干预后，与模型组比较，脑尔康干预各组及吡拉西坦组海马区LRP的表达明显增加（P＜0.01或P＜0.05），脑尔康三个剂量组之间差异显著（P＜0.05或P＜0.01），其中中药大、中剂量组作用最为显著；同时相应海马区Aβ1－42的含量较模型组下降（P＜0.01）。由此推测脑尔康可能通过上调海马LRP的表达，降低海马Aβ1－42的含量而发挥抗Aβ沉积作用，但确切机制有待于实验进一步证实。

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