于 倩 张 沫 刘德敏

糖尿病肾病（DN）早期处于高功能状态，肾血流量增加，肾小球滤过率增高，尿微量蛋白正常，病理变化表现为肾小球肥大，系膜基质轻度增宽，肾小球基底膜轻度增厚。这种过程是可逆的，但随着病程延长，当尿蛋白排泄率超过0.5 g/d时，即为临床糖尿病肾病期，此过程不可逆，最终发展为终末期肾病，只能依靠肾移植、血液透析和腹膜透析等肾脏替代疗法来维持生命，因此积极探索DN的发病机制，在DN早期给予适当及时的干预措施至关重要。在DN发病机制的研究中，由糖基化终末产物介导的转化生长因子（TGF）-β1/Smad/结缔组织生长因子（CTGF）通路最为重要，大量研究表明TGF-β 1和CTGF在肾病进程中起着关键作用[1]，但TGF-β1和CTGF基因表达与早期DN的关系还不清楚。本研究旨在探讨TGF-β1和CTGF基因表达与糖尿病早期肾脏病变的关系及其作用机制，为临床DN的早期治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）实验动物。清洁级雄性SD大鼠27只，购自天津实验动物中心，8周龄，体质量250～300 g，平均（281±11）g。实验期间标准条状饲料喂养，自由进食、饮水，每笼6～7只，自然昼夜光线，室内通风良好，室温18℃～22℃，相对湿度40%～70%。（2）主要试剂。链脲佐菌素（STZ，Sigma公司），Trizol、逆转录试剂盒（北京全式金公司），Real-time PCR试剂盒[大连宝生物（TaKaRa）公司],小鼠抗TGF-β1单克隆抗体、山羊抗CTGF多克隆抗体（Santa Cruz biotechnology），SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒（武汉博士德公司）。（3）主要仪器。德国BIOSEN血糖分析仪，芬兰Quik read快速分析仪，日立CF-15D冷冻离心机，中国博日Line-Gene K荧光定量PCR仪。

1.2 动物模型的建立与分组 全部动物适应性喂养1周后随机分为2组：正常对照组（NC）12只，糖尿病组（DM组）15只。将STZ溶于0.1mol/L的无菌枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液（pH 4.4），配成2%的溶液。DM组大鼠按40 mg/kg体质量尾静脉注射STZ，对照组注射枸橼酸钠缓冲液。给药后72 h和第7天尾静脉取血测随机血糖，2次血糖均≥16.7 mmol/L为造模成功，共14只成模为DM组。

1.3 标本收集与处理 自成模之日起，每2周测血糖1次。第8周时将大鼠置于单个代谢笼中，收集24 h尿液，记录尿量，3 000 r/min离心3 min后留取上清于-20℃保存，用于24 h尿微量蛋白（UMA）的测定。第8周末，将全部大鼠称质量，测血糖，股动脉放血将大鼠处死，留取血标本，3 000 r/min离心5 min后取血清于-20℃冻存，待测血糖、血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）等生化指标。将大鼠腹腔打开，迅速摘取双肾，左肾称质量后迅速放入10%福尔马林固定，右肾去除包膜后留取肾皮质部分于冻存管中，编号后放入液氮保存，24 h后放入-70℃冰箱中冻存备用，用于Real-time PCR测定。

1.4 实验方法

1.4.1 生化指标的测定 血糖检测用葡萄糖氧化酶电极法，BUN、Scr测定用酶法，24 h尿微量蛋白检测用免疫透射比浊法。

1.4.2 肾脏肥大指数（KI） 用肾质量/体质量（g/kg）比值表示。

1.4.4 肾皮质TGF-β1、CTGFmRNA表达测定 （1）肾皮质总RNA提取。用Trizol按步骤提取大鼠肾皮质总RNA，紫外分光光度计测定每个样品OD260/OD280比值，结果在1.8～2.0为纯度较高，并计算浓度，采用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性。（2）cDNA的合成。以RNA为模板，oligo（dT）为引物，在逆转录酶MMLV的催化下合成cDNA。（3）引物合成。根据引物设计原则，应用Primer 6.0软件设计引物，′用NCBIblast评价，再由上海生工合′成。β′-actin引物上游5-CCCATCTA TGA′GGGTTACGC-3，下游5-TTTAATGT′CACGCACGATTT C-3，扩增产物1′50 bp；TG′F-β1引物上游5-CAACAACG′CAA TCTATGACA-3，下游5-CAAGG′TAACGCCAGGAAT-3，扩增产′物 200 bp′；C TGF引物上游5-TGCCTG′CCATTACAACT G-3，下游5-CACACGGTTCTCACTTCG-3，扩增产物247 bp。（4）Real-time PCR。SYBRGreenⅠ与双链DNA结合后发出荧光，通过检测反应体系中的SYBRGreenⅠ的荧光强度监测RCR产物的扩增量。反应体系包括12.5μL SYBR Premix Ex Taq，上下游引物各0.5μL，cDNA模板2μL，ddH2O 9.5 μL，总体系为25μL。PCR扩增条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火及延伸30 s，共40个循环；最后生成熔解曲线。目的基因与内参基因扩增阈值的差值，即△Ct值，根据公式2-ΔCt计算出样品初始模板量进行分析。

1.4.5 免疫组织化学法检测 固定的肾组织经乙醇逐级脱水，石蜡包埋切片（4μm），用免疫组化SABC法检测。实验中TGF-β1、CTGF蛋白一抗浓度为1∶150，用PBS代替一抗做阴性对照，4℃孵育过夜，滴加二抗，DAB显色，苏木素复染。结果分析参考文献[2]，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统对图像进行分析,每张切片随机读取10个不重叠的视野，计算其积分光密度（IOD），取其均值进行统计学分析。

1.5 统计学分析 应用SPSS17.0统计软件做数据分析。所有资料均进行正态性检验，计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组间比较采用独立样本t检验；非正态分布资料以中位数（四分位数间距）表示，2组间比较采用Mann-Whitney检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物成模情况及体征观察 DM组大鼠于造模3 d后出现多饮、多食、多尿症状，常伴有腹泻，毛发干枯发黄，随时间的推移体质量明显减轻，活动量减少，精神萎靡。NC组大鼠皮毛光滑、毛色正常，体质量随周龄增加而增加，精神状况佳，饮食、饮水正常，尿淡黄色，大便颗粒状。实验期间NC组大鼠无死亡，DM组死亡2只，主要集中在造模后2周。

2.2 实验室检查结果 前4周时，与NC组相比，DM组血糖明显升高（P<0.01）；6周后，DM组血糖略有降低，但仍明显高于NC组，见表1。与NC组相比，DM组血肌酐明显下降，血尿素氮明显升高（均P<0.01），见表2。与NC组相比，DM组24 h尿量升高明显，24 h UMA、肾肥大指数也明显增高，差异均有统计学意义（P<0.01），见表2。

与NC组相比，DM组TGF-β1、CTGF mRNA水平明显升高（P<0.01），见表3。

免疫组化结果显示，NC组肾脏TGF-β1在肾小球轻度染色，DM组肾小球着色明显增多增深，蛋白表达较NC组高（P<0.01）；NC组肾小球未见明显着色，而DM组大鼠肾小球CTGF表达增多着色明显，差异有统计学意义（P<0.01），见表3，图1、2。

Table1 Comparison of blood sugar in different rat groups表1 各组大鼠不同周龄血糖比较 （n=12，mmol/L，±s）

Table1 Comparison of blood sugar in different rat groups表1 各组大鼠不同周龄血糖比较 （n=12，mmol/L，±s）

**P<0.01；表2、3同

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Table 2 Comparison of correlation index of renal function between rat groups表2 各组大鼠肾功能相关指标比较 （n=12）

Table 3 Expression levels of TGF-β1,CTGF mRNA and protein in rat renal cortex表3 大鼠肾皮质TGF-β1、CTGF mRNA及蛋白表达水平（n=12，±s）

Table 3 Expression levels of TGF-β1,CTGF mRNA and protein in rat renal cortex表3 大鼠肾皮质TGF-β1、CTGF mRNA及蛋白表达水平（n=12，±s）

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Figure1 Resultsof nephridialtissue TGF-β1 detected by immunohistochemistry图1 肾组织TGF-β1免疫组化结果（SABC法×400，箭头所示为阳性棕色颗粒沉着）

Figure2 Resultsof nephridialtissue CTGFdetected by immunohistochemistry图2 CTGF肾组织免疫组化结果（SABC法×400，箭头所示为阳性棕色颗粒沉着）

3 讨论

3.1 糖尿病肾病大鼠模型的建立 目前，STZ诱导建立的DM模型广泛应用于DN发病机制和治疗方法的研究。STZ通过选择性抑制β细胞O-乙酰葡萄糖胺酶（O-GlcNAcase）的活性，从而抑制O-乙酰葡萄糖胺的降解，使β细胞内蛋白质不可逆地糖基化，导致β细胞死亡。高剂量注射STZ使胰岛素分泌严重受损，模拟了1型糖尿病；而低剂量STZ使胰岛素分泌轻度受损，具有2型糖尿病后期的特征[3]。近来研究发现，采用单侧肾脏切除或单侧肾脏结扎后再小剂量注射STZ，也可以成功建立DN模型，但是由于难于分辨单侧肾损伤和STZ诱导高血糖对肾小球血流动力学改变的作用，该模型的应用价值尚待讨论[4]。无论从肾脏生理解剖特点还是DN的发病机制、病理特征等方面，还没有一种动物模型能完全模拟人类的糖尿病肾脏损害，应根据研究目的选择模型的建立方法。本实验研究早期DN的分子机制及可能的治疗方法，因此采用尾静脉小剂量注射STZ的方法建立DN模型。

3.2 细胞因子与DN TGF-β1是DN病程进展的重要细胞因子，是导致细胞外基质（ECM）过度沉积的关键因子，通过TGF-β/Smad通路与靶基因的启动子区域结合，调控其转录[5]，其中CTGF是其主要的效应因子，与TGF-β1共同参与肾脏肥大、系膜基质扩张、胶原增加和纤维黏连蛋白mRNA的表达等作用。CTGF是一种富含半胱氨酸的分泌蛋白，能与多种细胞因子相互作用，在维持细胞外基质的动态平衡中发挥了重要作用[6]。CTGF通过vWC结构域与TGF-β1结合，从而加强TGF-β1与相应受体的结合，提高了TGF-β1的有效浓度，同时还参与调节其信号转导。研究显示，在CTGF基因缺失或基因敲除的细胞中，由TGF-β1介导的30%的基因都失去了对它的反应[7]。TGF-β1功能的实现离不开CTGF,只有当两者协调作用时，才能促使发生持续的纤维化反应[8]。

3.3 糖尿病肾病标志物 在肾脏疾病中，特别是DN，UMA可以预示肾功能的损害程度，与肾病的进程密切相关。李世芬等[4]通过检测STZ诱导的DN大鼠的24 h尿蛋白排出量发现，模型组在造模1周时就明显升高，提示此时就已经存在肾功能的损害，并且排出量随着病程的延长而增多。但是，近来研究发现肾小球及肾小管损伤引起的细胞内蛋白质的变化要早于尿蛋白的出现[9]，UMA用于诊断DN的进程具有较高的灵敏度，但是特异度较低。

DN早期病理生理改变主要是高滤过和微量蛋白尿，随后出现肾功能进一步损害。本研究DM组大鼠的病变处于糖尿病肾病早期，DM组CTGF mRNA及蛋白表达较NC组明显升高，说明CTGF表达在肾病早期即有增加。有研究显示，与正常蛋白尿的DN患者比较，微量蛋白尿组的DN患者尿中的CTGF高出10倍，大量蛋白尿组高出100倍[10]。Je⁃rums等[11]研究表明，CTGF阳性细胞数及尿CTGF与肾组织活检纤维化评分呈正相关。这些结果提示通过检测CTGF来评价肾脏损伤将具有更好的特异性，有研究者提出联合应用CTGF与UMA来区分大血管损伤性疾病和肾脏疾病[12]，这对DN的早期诊断将更有意义。

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