徐忠秀 综述 秦卫松 审校

表观遗传学是针对不涉及DNA顺序变化而表现为DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和RNA干扰等基因表达水平调控在细胞亲代与子代间传递的遗传现象的一门科学。在真核细胞的正常发育中，DNA甲基化谱、组蛋白修饰和染色质状态的确定和时空变化受着精细调控，环境、饮食和其他潜在外部因素都可通过表观遗传机制影响基因表达。表观遗传学调节机制异常参与多种疾病(包括肾脏疾病)的发生。本文综述与肾脏疾病相关的表观遗传学机制最新研究内容。

表观遗传学主要研究内容

DNA甲基化 DNA甲基化是由甲基化转移酶(DNA-methyltransferase，DNMT)作用，在胞嘧啶第5位碳原子上共价添加一个甲基，是最早发现的基因表观修饰方式之一，可能存在于所有高等生物［1］。在真核生物中已发现3类DNA甲基转移酶(Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt3b)，其中 DNMT1 起维持甲基化作用，参与DNA双链中新复制合成链的甲基化［2］;DNMT3a和DNMT3b起形成甲基化作用，能使未发生甲基化的DNA双链甲基化［3］。人类基因组中70%～80%CpG(核苷酸对，其中G在DNA链中紧随C后)双核苷酸处于甲基化状态，非甲基化CpG并非均匀分布，有局部聚集倾向，形成一些GC含量较高、CpG双核苷酸相对聚集的区域(即CpG岛)。据统计超过50%的基因启动子区含有CpG岛。早期认为CpG岛是非甲基化的，但近来研究发现，在印迹基因、失活的X染色体甚至正常体细胞都有甲基化的CpG岛，其异常甲基化常伴随着疾病的发生［4］。

由于胞嘧啶甲基化会引起染色体压缩和基因沉默，所以对表达活跃的基因而言，其启动子和增强子区域的DNA往往处于低甲基化状态。因此，DNA去甲基化对于沉默基因的转录重激活起重要作用。近两年主动去甲基化机制已成为表观遗传研究领域的热点。研究发现，在Tet1加氧酶作用下，5-甲基胞嘧啶(5mC)可进一步被氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，通过酶促反应可将甲基基团以甲醛的形式从5hmC上移除［5］。DNA中的5mC和5hmC都可以被Tet家族的双加氧酶进一步氧化为5-羧基胞嘧啶(5caC)，胸腺嘧啶DNA糖基化酶可以特异性地识别这一新的碱基修饰形式，并将其从基因组中切除。

组蛋白修饰 组蛋白修饰即在其核心组蛋白N末端会发生多种共价修饰，包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化、糖基化等，这些修饰能影响染色质的压缩松紧程度，进而影响基因转录。组蛋白翻译完成后，其氨基末端发生的这些修饰方式共同构成了“组蛋白密码”(histone code)。组蛋白密码组合变化非常多，在基因表达中起重要的调节作用，其中甲基化和乙酰化是组蛋白最重要的修饰方式［6］。

组蛋白乙酰化受组蛋白乙酰化酶(histone acetyltransferase，HAT)和去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)的调节，多发生于N-末端保守的赖氨酸残基上。乙酰化减弱了组蛋白与DNA的结合，使染色质构象处于开放状态，有利于DNA的基因转录和表达。一般情况下，转录活跃区的核小体组蛋白处于高乙酰化状态，而不活跃区则呈低乙酰化状态。

组蛋白甲基化发生在精氨酸的胍基或者赖氨酸的ε-氨基上。组蛋白甲基化具有重要的生理功能，由于组蛋白中精氨酸和赖氨酸残基甲基化后并不改变组蛋白的电荷，因此这种修饰被认为是通过招募效应分子而发挥作用。

非编码RNA 非编码RNA是指不能翻译为蛋白质的功能性RNA分子，分为看家非编码RNA和调控非编码RNA，其中调控非编码RNA按其大小又非为两类:短链非编码 RNA(包括 siRNA、miRNA、piRNA)和长链非编码 RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)。近年来大量研究表明非编码RNA在表观遗传修饰中扮演了重要角色，能在基因组水平和染色体水平对基因表达进行调控［7-11］。

siRNA能在哺乳动物细胞中介导DNA甲基化和组蛋白修饰，从而导致转录基因沉默(transcriptional gene silencing，TGS)［7，8］。microRNA(miRNA)与siRNA密切相关，两者片段大小相近，均经Dicer加工后装载至Argonaute蛋白而发挥作用，因此推测miRNA也能介导TGS，而且两者作用机制有所重叠。Lewis等［9］通过对13 000多个人类基因的研究进一步推测:组蛋白甲基化酶、甲基化CpG结合蛋白、染色质域蛋白及组蛋白去乙酰化酶等均是miRNA潜在的作用靶标。

piRNA(Piwi interacting RNA，piRNA)因其在生理状态下能与Piwi蛋白偶联而得名，由于Piwi为一表观遗传学调控因子，因此推测piRNA也应具有表观遗传学调控作用［10］。哺乳动物细胞piRNA分为两个亚簇:粗线期piRNA簇主要出现于减数分裂的粗线期，持续表达至单倍体精子细胞阶段，一般很少有重复片段;粗线前期piRNA簇主要出现于减数分裂前的生殖细胞，具有重复片段。但是目前对于piRNA的生物合成和作用机制尚不清楚。

lncRNA是指＞200nt的RNA，位于细胞核内或胞质内。虽然lncRNA有多种不同来源，但研究证实其在基因表达调控方面作用相似(表1)［11］。

表1 表观遗传学中起主要调控作用的非编码RNA

肾脏疾病与表观遗传学

糖尿病肾病 糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)的严重并发症之一，高血糖是导致DN的最主要原因，其中涉及多种生物机制，例如糖化代谢终产物、促炎性细胞因子、生长因子等均能促进肾脏纤维化及损伤［12，13］。近年虽然一些药物可改善 DM患者预后，但仍有很多患者进展至终末期肾病(ESRD)。此外，临床和实验均证实，确诊DM之前，患者就已经出现糖耐量异常，机体形成代谢记忆，为并发症埋下隐患［13，14］，同时也提示表观修饰异常可能参与DM及其并发症的发病机制。

有研究发现某些DNA甲基化参与DM发生。例如转录辅助活化因子1α(PGC-1α)表达下降导致糖尿病db/db小鼠胰岛素分泌减少［13］。在 DN和慢性肾脏病(CKD)患者中均发现不同程度的DNA甲基化［15］。组蛋白转录后修饰也参与DM的发生，不同血糖条件下Pdx1转录因子介导的胰岛素基因表达［15，16］和脂肪细胞的分化中均可见组蛋白修饰异常。此外，敲除Jhdm2a(H3K4去甲基化转移酶)基因的实验小鼠出现肥胖和高脂血症［15］。

核因子κB(NF-κB)是肾脏疾病的一个重要炎症介质［17］。有证据表明组蛋白修饰以及相关的酶，可调节正常及糖尿病时血管内皮细胞及单核细胞NF-κB介导的炎性分子表达，另外，染色质免疫沉淀及芯片分析发现，DM患者外周血单核细胞基因组H3赖氨酸甲基化水平发生明显改变，也证明表观修饰异常在DM及其并发症中起重要作用［13］。然而，有关组蛋白修饰在DM肾脏细胞中作用的相关研究有限。近来，研究发现转化生长因子β(TGF-β)和高血糖均能诱导小鼠肾间质纤维化基因(结缔组织生长因子、胶原-α1和纤溶酶原激活剂抑制物1)表达，该基因启动子区域H3K4甲基化升高，H3K9甲基化水平降低，此外TGF-β同时能上调H3K4甲基转移酶SET7/9基因的表达，而SET7/9基因沉默能抑制TGF-β诱导的纤维化基因表达。有趣的是，TGF-β抗体能阻断高糖诱导的纤维化基因表达以及逆转高糖诱导的间质细胞启动子的组蛋白修饰(图1)［16］。

图1 TGF-β介导的糖尿病肾损伤中的表观遗传机制［16］

缺血再灌注肾损伤 缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion，I/R)是肾脏外科手术及肾移植后急性肾损伤(AKI)的主要原因，而炎症则是I/R时导致器官损害的直接因素，然而，人们对内源性抗炎通路对肾脏I/R的保护机制缺乏深入了解。最初研究发现，HDAC参与脑和心脏的I/R。Li等［18］观察发现肾脏I/R后，激活性转录因子3(activating transcription factor3，ATF3)表达上调，ATF3基因缺陷的小鼠肾脏I/R发生后，死亡率升高，肾功能损伤明显，炎症反应严重，其可能机制为ATF3能够招募HDACs到达白细胞介素6(IL-6)和IL-12b启动子区域的ATF/NF-κB位点，从而改变染色质构象，影响NF-κB与转录启动子的结合，进而影响DNA转录。

在I/R恢复阶段，表观修饰参与一些保护因子的作用机制，如成骨蛋白 7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)［19-21］。Marumo等［21］研究发现小鼠I/R时肾小管上皮细胞组蛋白乙酰化水平短暂降低，同时，细胞体外实验也发现此期细胞HAT表达下降。而在恢复期，HDAC的一种同工酶HDAC5表达下调，与之相平行出现的是组蛋白乙酰化水平升高。敲除HDAC5基因的小鼠表现出组蛋白乙酰化和BMP-7表达升高。短暂缺血后，可以观察到在恢复期小鼠肾小管上皮细胞BMP-7表达升高和HDAC5表达下调(图2)。这些数据表明，I/R诱导表观修饰发生了动态改变，其中包括HDAC5表达的下调，以及恢复期组蛋白的再乙酰化和BMP-7表达的升高。因此，HDAC5可能是I/R的一个重要调节因子，抑制HDAC5、增高BMP-7的表达可能将成为I/R的一种治疗策略。

慢性肾脏病(CKD)CKD的进展与炎症、氧化应激、多种毒素体内蓄积以及代谢紊乱相关，这些因素均可能引起机体表观修饰的改变(图3)［22］。

有证据表明RNA干扰在肾脏疾病的发生和发展中发挥重要作用［23，24］。miRNA 参与维持肾小球的自稳态，RNA干扰可能在肾脏病进展中起作用［23］。Dicer酶(参与 miRNA 生成的酶)敲除的小鼠，出生后2～3周出现蛋白尿，最终因肾功能衰竭而死亡。肾脏病理可见肾小球纤维化，足细胞凋亡、足突消失;肾间质增宽［23］。阻断小鼠足细胞miRNA的生成，也可导致小鼠出现蛋白尿、足细胞去分化及肾小球新月体形成，最终发展为ESRD［24］。

图2 肾缺血再灌注损伤时肾小管上皮细胞损伤修复的表观遗传机制［20］

图3 慢性肾脏病(CKD)的影响因素与表观遗传［22］

CKD和ESRD患者均可出现高同型半胱氨酸血症，伴S腺苷同型半胱氨酸升高。同型半胱氨酸前体S-腺苷同型半胱氨酸是S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲基转移酶的强拮抗因子，同时也是导致DNA甲基化改变的重要因子之一，在多种高同型半胱氨酸血症性疾病(包括尿毒症)中均增高。事实上，血清中S-腺苷同型半胱氨酸水平升高在伴有血管疾病的CKD患者中已有报道［25］。这也提示在CKD患者中肾脏病的进展和心血管疾病(CVD)中可能均涉及到表观修饰异常。

CKD患者存在免疫应答异常。免疫应答激活是一个高度协调的多级联过程，其中也包括表观遗传的调控机制［25］。甲基化和乙酰化的动态变化在特异性抗原免疫应答中起重要作用［26］。转录因子和其他信号分子的表达受到表观调控机制的调控。基因沉默受损可导致异常免疫激活和细胞因子过度活化。如高甲基化可导致细胞因子信号肽基因抑制物(SOCS)失活从而引起异常炎症反应［27］。

CKD患者肾活检病理检查可见细胞外基质(extracellular matrix，ECM)增多，甚至纤维瘢痕形成，而瘢痕中的成纤维细胞在体外培养后仍可处于持续活化状态，表观修饰异常可能参与了肾脏纤维化形成。TGF-β1诱导的 ECM增多在 CKD和 DN进展中起重要作用。Sun等［28］发现TGF-β1可在正常及高糖条件下诱导小鼠系膜细胞某些基因发生表观修饰改变，如组蛋白H3赖氨酸甲基化。TGF-β1能够增加ECM相关基因如结缔组织生长因子、胶原α1和纤溶酶原激活剂抑制物1的表达，这一过程中相关染色质的活化基因启动子区域(H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3)甲基化水平升高，抑制基因(H3K9me2、H3K9me3)甲基化水平下调。TGF-β1抗体不仅能阻断高糖诱导的ECM基因表达，而且还能逆转H3Kme启动子甲基化的改变。这些结果说明组蛋白甲基化在正常和高糖条件下参与了TGF-β1诱导的 ECM增多的过程。另有研究发现，RASAL1(编码Ras癌基因抑制因子)基因在纤维化肾脏的成纤维细胞中高度甲基化［29］。RASAL1的高甲基化由甲基转移酶Dnmt1所催化，在Dnmt1+/-的杂合子小鼠，肾脏纤维化程度得以改善。

环境、肾脏疾病和表观遗传学 虽然遗传突变可直接影响细胞表型而致疾病发生，但并非所有疾病都与遗传有关。环境因素可经表观遗传机制影响表型从而导致疾病。Conrad Waddington最初用‘epigenetics’一词解释基因和环境的相互作用，可见环境对表观遗传有很大影响(图4)［30］。甲基基团主要来自于饮食，通过叶酸和甲硫氨酸途径添加至DNA，因此饮食结构不合理可能会导致低甲基化状态和遗传不稳定性。事实上，全基因组甲基化胞嘧啶含量受叶酸营养利用度的影响。研究证实感染(尤其是病毒感染)会触发DNA甲基化［31］。甲基化作用的丢失和转录抑制作用的减弱会导致正常状态下沉默的基因再表达，如印记基因、插入的病毒基因和重复原件的活化，导致潜在的有害基因表达。此外，流行病学发现吸烟和DNA甲基化之间也存在一定联系。环境易感性与基因易感性密切相关，一些潜在的基因突变使得表观修饰易于发生，这也从另一方面解释了表型与环境之间的相互作用。例如，亚甲基四氢叶酸还原酶的多态性与DNA甲基化有关，而这种相关性又受饮食、饮酒和疾病调控。因此，表观遗传修饰的改变是饮食结构的改变、遗传多态性和环境暴露因子等多种因素共同作用的结果。

图4 基因型、表观修饰和环境共同决定细胞的表型［30］

已经有报道指出环境因素能够引起表观修饰改变，如三氯乙烯能够导致实验小鼠发生肝癌，发生癌变的小鼠体内c-jun和c-myc基因启动子区域甲基化程度降低，在肝脏中这两种基因的mRNA和蛋白表达水平也升高［32］。另外，在大剂量苯诱导的急性淋巴细胞白血病小鼠体内也发现了相关基因甲基化水平降低;同时也有研究证实空气中的苯能导致p15基因高甲基化，黑色素瘤抗原1(MAGE-1)低甲基化［33］。

随着经济发展和居住条件的改善，我国由非环保建材和室内装饰材料所引发的病态建筑物综合症(sick building syndrome，SBS)或病态居室综合症(sick house syndrome，SHS)的发病率明显增高，人们越来越关注室内环境因素(indoor environment)在人类疾病中的作用，但对其导致的机体损害及其机制认识不足。近年来，因接触有机溶剂引起肾脏病损害的病例逐渐增多［34］，且动物模型也证实有机溶剂的确能引起大鼠蛋白尿、广泛肾小管上皮细胞损伤和节段肾小球足细胞损伤等肾脏病变，但其发病机制尚不清楚［35］。有机溶剂是否通过表观遗传机制导致肾脏疾病的发生尚有待进一步研究证实。

展 望

表观遗传学作为一种新的疾病调控机制，已经成为现代遗传学研究的热点问题。表观遗传学不仅揭示了很多疾病新的发病机制，同时也是开发新治疗策略的基础。理论上，与传统药物相比，表观遗传药物具有较高的治疗潜力和相对较低的不良反应，一些DNA甲基化抑制剂、HDAC抑制剂等正在研发中，将为肾脏疾病的治疗带来新希望。

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