潘 敏，王 海，张 铎，李 妍＊

（1.武警吉林省总队医院，吉林 长春130052；2.吉林大学中日联谊医院 检验科，吉林 长春130033；3.吉林医药学院免疫学与病原学教研室，吉林 吉林132013）

丝裂源活化的蛋白激酶（mitogen－activated protein kinases，MAPKs）家族参与细胞生长、增殖、分化和凋亡等重要过程。MAPK家族成员p42／44MAPK（Erk1／2）在生长因子、细胞因子、营养物质和能量刺激下活化，促进细胞增殖或抵抗凋亡；Erk1／2分子中Thr202和Tyr204位氨基酸残基的磷酸化是其活化的标志［1］。经典的检测蛋白激酶表达与磷酸化的方法是蛋白印迹（western blotting，WB）技术，但 WB步骤繁琐，所需时间长，技术难掌握。流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测细胞内细胞因子方法的建立，启发了人们探索应用FCM检测细胞内蛋白激酶。有学者应用直接荧光染色来分析细胞内蛋白激酶，但以间接荧光染色检测蛋白激酶的则未见报道［2］。本研究优化了细胞固定、打孔和洗涤等条件，采用非标记的一抗和荧光素标记二抗联合标记，即间接荧光染色－流式细胞术分析细胞内磷酸化Erk1／2，所建立的检测方法可获得强而特异的信号。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺腺癌细胞A549引自美国典型物种保藏中心，Erk1／2的抑制剂PD98059购自Sigma公司（美国）。1640培养液购自GBICO公司（美国），小牛血清购自浙江黄岩四季青生物技术公司。β－actin、Erk1／2、磷酸化 Erk1／2（p－Erk1／2）（磷酸化位点为Thr202和Tyr204），购自Cell signaling公司（美国），3种抗体均为兔多抗。FITC标记二抗和HRP标记二抗购自中杉公司（北京）。PVDF膜、BCA蛋白定量试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒和兔IgG购自碧云天生物技术研究所（上海）。

1.2 细胞培养

用含10%小牛血清的1640培养液，在5%CO2、37℃和饱和湿度条件下培养A549细胞，取对数生长期细胞用于实验。……