唐于荔 王文敏 俞志鹏

特发性全面性癫痫 （idiopathic generalized epilepsies，IGE）约占癫痫患者的 20% ～ 30%［1］多无明确发病原因，神经影像学检查脑部无明显的器质性改变，有一定年龄依从性、以儿童和青少年多见的一类全面性发作的癫痫。多年来，研究者进行癫痫发病机制的探讨，发现遗传因素在特发性癫痫中具有重要影响，编码离子通道的基因突变是造成离子通道异常的原因［2］。目前钠、钾、钙、氯离子通道与IGE相关性研究较为明确［3］。自Haug.K等［4］发现了涉及原发性全面性癫痫综合征亚型的CLCN2基因突变后，人们不断对此区域进行研究，发现了几十种单核苷酸多态性［5-7］。2007年梁丽君等［8］首次对云南少数民族（基诺族）和汉族特发性全面强直-阵挛性癫痫与CLCN2基因相关性进行研究。此次我们增加样本量，应用病例-对照方法首次研究云南省5个独有少数民族（基诺族、阿昌族、布朗族、佤族、拉祜族）IGE与CLCN2基因中3个SNP 位点 rs2228291、rs6770808、rs6773786 之间 相关性，旨在为特发性全面性癫痫病因学提供实验依据。

1 对象与方法

1.1 对象与分组 本研究中入选IGE患者的诊断主要根据1989年国际抗癫痫联盟（IEAE）分类及命名委员会提出的癫痫及癫痫综合征分类诊断标准确定发作类型，参阅流行病学病例确定标准及WHO在中国使用的癫痫调查问卷，入组标准为：①准确的病史和特征：患者有2次以上典型癫痫发作病史，可表现为全面性强直-阵挛性发作、儿童失神性癫痫、青少年肌阵挛性癫痫、青少年失神性癫痫等；②智力正常及除痫性发作外无其他神经病学体质；③抗癫痫药物有效。排除标准为：①仅有热性惊厥或新生儿抽搐不诊断为癫痫；②已明确由于脑部疾病急性期诱发引起的痫性发作不纳入研究对象［9－10］。少数民族对照组为无癫痫病史的云南健康人群。

具体分组为：①少数民族病例组：包括上述5个少数民族共92例。基诺族患者为2005年10月至12月在云南省西双版纳傣族自治州入户收集，阿昌族患者于2008年1月在德宏傣族景颇族自治州入户收集，布朗族、佤族、拉祜族于2007年6月在临沧地区入户收集。②少数民族对照组：共170例，为同期收集的上述5个少数民族IGE患者的一级亲属。

1.2 方法 ①血样采集及预处理：采集每位研究对象外周静脉血2 mL放于EDTA抗凝管中，并加入等体积DNA保存液，－80℃低温保存待用。②DNA提取：采用苯酚－氯仿法提取外周血白细胞基因组DNA。③PCR反应：根据本实验3个CLCN2多态性位点信息（见表1）设计引物。PCR反应总体积为20 μL，含基因组 DNA 1.5 μL，10X PCR Buffer（Mg2＋Free）2 μL，MgC12（12.5 mM）1.5 μL，Mixture（各 1.25 mM）1.5 μL，引物 1（up）（10 μM）0.1 μL，引物2 （down）（10 μM）0.1μL，rTaq DNA 聚合酶0.2 μL。 反应条件：94℃ 预变性 2 min，94 ℃变性20 s，Tm 退火 25 s，72℃ 延伸 30 s，35 次循环后 72℃延伸10min。④单碱基延伸（SNapshot）反应及测序测序胶图经Applied Biosystem自带的Sequencing Analysis 5.2分析软件分析后转化为测序结果，测序结果再用SeqMan软件进行经手工校正无错读的序列成为原始数据。

1.3 统计学方法 将实验原始数据录入SPSS 17.0软件数据库并对其进行统计学处理。各组间进行遗传平衡适合性检验，等位基因频率（allele frequency）及基因型频率（genotype frequency）的比较均采用卡方检验 χ2，检验水准 α ＝ 0.05。

2 结果

2.1 一般情况 少数民族病例组共92例，男57例，女35例。少数民族对照组共170例，男84例，女86例。

2.2 遗传平衡检验 CLCN2基因SNP位点rs2228291、rs6770808在少数民族病例组及对照组处于 Hardy-Weinberg平衡状态（P ＞ 0.05），位点rs6773786在少数民族病例组及对照组不处于Hardy-Weinberg平衡状态（P ＜ 0.05）。

2.3 病例－对照研究结果 3个SNP位点在少数民族病例组与对照组间基因型频率独立性检验：rs2228291、rs6770808、rs6773786 各位 点基因 型频率在少数民族病例组与对照组间比较均没有统计学意义（P ＞ 0.05）（见表 2）。

3个SNP位点在少数民族病例组与对照组间等位基因频率检验：rs2228291、rs6770808、rs6773786各位点基因型频率在少数民族病例组与对照组间比较没有统计学意义（P ＞ 0.05）（见表3）。

3 讨论

癫痫是一种常见的脑部疾病，在神经系统疾病中仅次于脑血管病变，频繁发作可引起记忆、学习、行为等全面而广泛的认知功能障碍，致伤、致残甚至危及生命，严重影响患者健康和生存质量。由于特发性癫痫的致病原因不明，探讨其发病机制对疾病的诊断、治疗、预防显得至关重要。自从Haug.K在特发性癫痫家系中发现了3种相关氯通道基因突变［4］，人们认识到电压门控氯通道CLC⁃2与原发性癫痫关系密切，CLC⁃2通道缺陷可致癫痫发作。

表1 CLCN2基因中3个SNP位点PCR扩增片段与引物序列相关信息

表2 少数民族病例组与对照组间CLCN2基因SNP位点基因型频率

表3 少数民族病例组与对照组间CLCN2基因SNP位点等位基因频率

国外学者对CLCN2基因突变与IGE的发病机制进行广泛研究，发现了CLCN2基因的数十种SNP改变，但研究结论不同。SNP（single nucleotide polymophism），即单核苷酸多态，是一种高效便捷的分子标记，更能反映个体特异性的特点。SNaP shot方法也称小测序，通常用于10～30个SNP位点分析，主要针对中等通量的SNP分型项目。

云南省是我国少数民族最多的省份，其丰富的少数民族资源、族内通婚习俗、居住相对集中、长期处于隔离或相对隔离状态、受外界影响相对较小等特点均有利于进行疾病的遗传学研究。本实验采用SNaP shot方法检测CLCN2基因多态性位点 rs2228291、rs6770808、rs6773786 是否与云南少数民族特发性全面性癫痫相关。

一般资料统计再次证实云南省5种少数民族IGEs发病年龄仍多在20岁之前，与目前流行病学调查研究结论相似［10-11］。本次研究rs2228291、rs6770808位点无论在少数民族病例组还是对照组均处于遗传平衡状态，说明样本代表性较好，符合遗传平衡状态。而rs6773786位点在少数民族病例组及对照组不符合Hardy⁃weinberg遗传平衡定理。分析其原因可能是：采样不是随机进行或和原发性全面性癫痫疾病相关。维持群体的遗传平衡需要一定的条件，或者说这种遗传平衡受一些因素的影响，例如群体要很大，必须是随机交配而非选择交配，不会因迁移而产生群体结构的变化等。CLCN2基因多态性位点 rs2228291、rs6770808、rs6773786 检测中云南少数民族病例组与对照组基因型频率、等位基因频率比较均无统计学差异（P＞0.05），说明上述3个CLCN2基因多态性位点与云南5种少数民族—基诺族、阿昌族、布朗族、佤族、拉祜族人群IGE可能无显著相关性。

本实验与既往研究有相似之处，也有不同，推测造成的原因可能是：①本实验研究对象针对云南五种少数民族IGE患者及其对照人群，可能存在种族差异性；②因各民族样本量少而合并成少数民族病例组可能对实验结果分析有一定影响；③本实验针对特发性全面性癫痫，且患者多表现为特发性全面强直-阵挛性癫痫，临床表型相对单一，可能致使研究结论的不同；④上述三个SNP位点位于CLCN2基因不同区域，而且每个基因SNP位点的作用有限，存在多个基因共同作用的可能，在重复性研究中可能会出现与既往研究报道不符的情况。

本研究探讨了云南少数民族人群IGE的可能发病机制，在后续研究中有必要扩大少数民族样本数量及癫痫发作类型进行SNP位点的功能研究、检测大样本全基因序列、多位点构成的单体型分析、异常蛋白质产物功能检测等工作，以早日阐明癫痫发病机制与遗传因素的关系，特别是IGE与基因突变之间的联系，在临床上对特发性癫痫的基因诊断及转基因治疗提供依据。

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［11］俞志鹏，唐艳湘，王文敏，等.中国云南佤族人群癫痫流行病学调查［J］.中华流行病学杂志，2009，30（1）：95-96.