梁国威，邵冬华，曹清芸，王树琴，王新华，徐雪松

（1.航天中心医院 检验科，北京100049；2.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033）

2005年多个研究组同时发现JAK2V617F（JAK2蛋白酪氨酸激酶基因）第1849位点突变（G＞T）与骨髓增殖性疾病（MPDs）有关，该突变可明显导致真性红细胞增多症（PV）、特发性血小板增多症（ET）和骨髓纤维化（IMF）的发生和发展［1－5］。2008年世界卫生组织（WHO）将JAK2V617F突变纳入到上述疾病的诊断标准中［6］。由于JAK2 V617F是获得性造血干细胞突变，骨髓和外周血中JAK2V617F呈不同细胞系的突变。Xu X［7］等报道在37例非MDPs诊断的JAK2V617F患者中，有25例JAK2V617F突变率小于5%，因此，对于JAK2V617F检测方法的敏感性，特别是少量突变克隆株的检测，显得尤为重要。

2008年，LI等［8］报道较低变性温度下复合扩增聚合酶链反应（COLD－PCR）可显著提高少量突变的检出率。其中快速COLD－PCR适用于变性温度（Tc）值降低的突变，其原理是（1）任何一段DNA序列都有其严格、特定的Tc值，Tc值不同可致扩增效率产生巨大差异；（2）当PCR反应的Tc值设定在突变（如G：C＞A：T；G：C＞T：A等）DNA序列时，由于该Tc值低于野生型DNA片段，导致PCR扩增中野生型DNA片段的双链大部分不能完全打开，而该Tc值可使得突变型DNA片段大部分双链打开，由此即可实现对突变型DNA片段进行富集，然后进行分析。

由于JAK2V617F突变是G＞T点突变，适合快速COLD－PCR方法，因此，本研究采用TaqMan／MGB突变探针作为突变碱基的指示信号，结合快速COLD－PCR原理，建立高敏感性的在外周血基因组DNA中定量检测JAK2V617F的突变率的Taq－Man－COLD－PCR方法。

1 材料与方法

1.1 纯合野生、纯合突变和外周血基因组DNA提取 采用天根生化科技（北京）有限公司的血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒（目录号：DP304－02），按试剂盒说明操作。提取的基因组DNA在－80℃冻存备用。其中纯合JAK2V617F突变细胞株（HEL，人红白细胞白血病细胞，购自中国科学院细胞库）经细胞培养至指数增长期后，提取基因组DNA；纯合野生（健康志愿者）和患者EDTA抗凝外周全血200μl用于基因组DNA提取。

1.2 质粒标准品的制备和基因组DNA浓度校准采用特异引物分别扩增纯合突变和纯合野生JAK2基因中第13外显子至第14－15间内含子共计1 818 bp，按常规方法构建JAK2V617F野生和突变质粒标准品，构建的质粒标准品经测序确认，并根据重组质粒分子量将质粒标准品换算并稀释成1×109～1×105拷贝数／ml。以质粒标准品作为实时荧光定量PCR检测标准曲线，将提取的HEL细胞株、健康志愿者和患者外周血基因组DNA的浓度校准为5.0×107拷贝数／ml。

1.3 JAK2V617F突变率标准品配制 将浓度为5.0×107拷贝数／ml的健康志愿者基因组DNA作为稀释基质，加入同等浓度的HEL细胞基因组DNA，进行浓度梯度稀释，配制成100%－0.1%的JAK2V617F突变标准品。

1.4 TaqMan－COLD－PCR引物和探针 上游引物：5′－TTG AAG CAG CAA GTA TGA TGA GC－3′；下游引物：5′－AGA AAG GCA TTA GAA AGC CTG TAG T－3′（由北京赛百盛基因技术有限公司合成）。TaqMan／MGB突变探针：与突变碱基匹配（其中下划线碱基是突变碱基），5′－FAM－TCC ACA GAA ACA TAC－MGBNFQ－3′；TaqMan／MGB通用探针：避开突变碱基，其与突变和野生皆可完全匹配，5′－VIC－ACA TAC TCC ATA ATT TA－MGBNFQ－3′，TaqMan／MGB探针由美国ABI公司合成。

1.5 检测仪器和反应体系构成 20μl反应体系，包括Taqman GT Master Mix 2×（购自美国ABI公司，目录号：4371355）10μl，探针1μl（终浓度0.25μM），上、下游引物各2μl（终浓度分别是0.2 μM），模板2μl（浓度5.0×107拷贝数／ml），水2 μl。其中，浓度校准和选择TaqMan－COLD－PCR 的Tc值时，采用TaqMan／MGB通用探针；检测JAK2 V617F突变率的标准曲线和标本检测采用Taq－Man／MGB突变探针。浓度校准仪器采用7500Real－Time PCR系统（美国ABI公司 ）；TaqMan－COLD－PCR Tc值的选择和检测方法建立采用Rotor－Gene Q real－time PCR分析系统 （美国QIAGEN公司）。

1.6 扩增条件 TaqMan－COLD－PCR Tc值的选择：（1）95℃，10min；（2）95℃－76℃，15s，62℃，40 s（读荧光值），50个循环，以确定最佳Tc值。JAK2 V617F突变率检测：（1）95℃，10min，（2）95℃，15 s；62℃，40s；8个循环，（3）79.0℃，15s；62℃，60s（读荧光值）；50个循环。

1.7 临床标本检测 共计9例患者，其中真性红细胞增多症患者（PV）8例，骨髓纤维化患者（IMF）1例，采用建立的 TaqMan－COLD－PCR方法检测JAK2V617F突变率，测序确认。

1.8 统计学方法 JAK2V617突变率与循环阈值（Ct值）间的相互关系和定标曲线的建立采用直线回归分析，采用SPSS10.0统计软件进行统计分析，以P＜0.05作为差别有显著性的标准。

2 结果

2.1 选择 TaqMan－COLD－PCR 的Tc值 分别以5.0×107拷贝数／ml浓度的人HEL细胞株和健康志愿者外周血基因组DNA作为模板，以TaqMan／MGB通用探针作为检测信号，逐渐降低变性温度，由95.0℃降至78.7℃。根据以下原则确定Taq－Man－COLD－PCR的Tc值：（1）突变和野生反应体系扩增曲线的Ct值差别最大；（2）突变反应体系的扩增效率最佳；最终确定TaqMan－COLD－PCR的Tc值是79.0℃，见图1。

2.2 TaqMan－COLD－PCR检测JAK2V617F突变率标准曲线的建立 将Tc值设定为79.0℃，将浓度5.0×107拷贝数／ml的含有100%、10%、1%和0.1%的JAK2V617突变的标准品同时重复测定2次。结果显示，检测突变率的下限是0.1%，JAK2突变率的对数值与Ct值间呈线性关系，线性回归分析显示：r＝0.993，P＜0.001，线性回归方程是：y＝－0.196x＋4.186。因此，根据测定的患者标本Ct值，通过回归方程计算即可获得该患者JAK2 V617F突变率，计算公式是：JAK2V617F突变率＝10（4.186－0.196×Ct值）。见图2。

图1 TaqMan－COLD－PCR选择Tc值的扩增曲线图

2.3 TaqMan－COLD－PCR方法检测患者标本结果

测定体系包括100%－0.1%突变率标准品和100%野生纯合标准品作为阴性对照，采用建立的TaqMan－COLD－PCR方法对9例患者标本进行检测，扩增曲线见图3。测定的9例患者中，真红8例，骨髓纤维化1例，8例真红中的6例患者JAK2 V617F突变率为18.5%－50.9%，2例真红和1例骨髓纤维化患者JAK2突变率为阴性。

图2 TaqMan－COLD－PCR检测JAK2V617F突变率PCR扩增曲线图和定标曲线图

图3 TaqMan－COLD－PCR测定9例患者标本扩增曲线图

2.4 患者标本测序结果

将9例患者标本通过常规PCR扩增后测序（扩增条件和引物同质粒标准品的制备），结果显示，TaqMan－COLD－PCR与测序结果全部符合。见图4。

3 讨论

本研究采用TaqMan／MGB探针作为检测信号，结合COLD－PCR扩增原理，成功建立了在外周血中定量检测JAK2V617F突变率的TaqMan－COLD－PCR方法，该方法通过测定患者外周血基因组DNA的Ct值，再根据突变率与Ct值的标准曲线回归方程，计算该测定标本中JAK2V617F的突变率。所建立 TaqMan－COLD－PCR 检测方法 可 对JAK2V617F突变率进行定量检测，并具有高突变检测敏感性、高通量检测、快速和无污染等特点，由于采用外周血标本进行检测，还具有操作简单的特点。

本研究建立的JAK2V617F突变率检测方法的检测下限是0.1%，明显优于其它JAK2V617F的检测方法。文献报道，DNA直接测序方法检测突变率的下限为20%［3］；等位基因特异PCR方法 敏感性为1%－3%［9］；荧光定量PCR－ARMS原理和溶解曲线方法的敏感性为1%［10，11］，限制性片段长度多态性 （RFLP）的敏感性为20% 左右［4］。由 于JAK2V617F已作为骨髓增殖性疾病重要的分子诊断标志物，提高该突变检测下限的敏感度将有助于临床对该类疾病的早期诊断。

图4 9例患者外周血基因组DNA中JAK2 V617F突变测序结果

COLD－PCR检测微量突变的原理是基于相同的DNA序列中野生和突变的变性温度不同所导致的扩增效率差异，对于G：C与T：A的突变导致Tc值仅存在1℃的差异［12］，本研究在 TaqMan－COLDPCR Tc值的选择中也观察到突变和野生间的扩增效率差异仅相差1℃（79.6℃－78.7℃），在既保证扩增效率又保证扩增效率差异的条件下，每0.1℃的变性温度改变都对实验有明显影响，因此，选择高精度温控的PCR扩增仪非常重要，PCR分析仪升温达到Tc值的温度过冲和孔间温差是影响本实验精确度和重复性的关键因素。

由于JAK2V617F是获得性造血干细胞突变，因此骨髓和外周血中JAK2V617F呈不同细胞系的突变。在外周血中，除粒系外，其它细胞系的基因组DNA 中皆不携带JAK2V617F突变［1，2，4］，因此，采用外周血基因组DNA检测JAK2V617F突变率不能达到100%。本研究通过建立的TaqMan－COLD－PCR方法测定了9例患者外周血中JAK2V617F突变情况，其中6例阳性患者的JAK2V617F突变率为18.5%－50.9%，除外淋巴细胞基因组后，6例患者外周血中JAK2V617F突变率是26.2%－62.3%。

采用紫外分光光度计进行基因组DNA浓度校准，通过Real－time PCR定量检测时，其拷贝数／ml并不相同，因此本研究首先对所有的基因组DNA中JAK2基因拷贝数／ml的浓度进行校准，然后再进行JAK2V617F突变率标准曲线的建立和患者标本检测。通过对基因组DNA进行拷贝数／ml的浓度校准，使得本研究中JAK2V617F突变率的检测更为准确。

综上所述，本研究建立的TaqMan－COLD－PCR方法，以外周血基因组DNA作为检测标本，可对JAK2V617F突变率进行定量检测，突变率检测下限为0.1%，该方法在一个反应体系内即可完成检测，具有操作简单、高通量检测标本、重复性好、检测报告时间短等特点。由于JAK2V617F突变已作为骨髓增殖性疾病的分子诊断标志物，该方法将明显提高骨髓增殖性疾病的诊断灵敏度，并有助于上述疾病治疗过程中治疗效果的监测。

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