韵雪雪，杨永长，姜 伟，肖代雯，闫 慧，黄文芳＊

（1.四川省医学科学院 四川省人民医院，四川 成都610072；2.重庆医科大学医学检验系 临床检验诊断学教育部重点实验室，重庆400016）

乳腺癌是一种严重危害育龄妇女健康的恶性肿瘤，占全身恶性肿瘤的7－10%，据统计，全球每年发病约250万人，50万人死亡。2004年Jemal等统计，早期诊断乳腺癌五年生存率可达97%，而扩散后的五年生存率仅为23%［1］。影像学检查和CA－153标志物是目前乳腺癌检查常用的技术指标，但由于乳腺炎症，射线过敏和敏感性方面的问题［2，3］，不足以满足临床和大规模筛查的需要，细胞膜在细胞生命活动中发挥重要作用，已有研究发现膜蛋白肿瘤过程中发生特异性变化［4］，SELDI－TOF－MS是目前蛋白研究的先进技术，具有高通量，检测快速，敏感度和特异性高，分析全面精确的特点，在蛋白质组学研究中应用广泛，本实验拟通过SELDI－TOF－MS分析乳腺癌及正常乳腺细胞株膜，寻找差异蛋白，为乳腺癌亚细胞蛋白水平标志物的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人类乳腺正常细胞株HBL－100购自上海中科院细胞库，人类乳腺癌细胞株MDA－MB－231及MCF－7均由重庆医科大学惠赠。

1.1.2 主要试剂及来源 细胞膜蛋白提取试剂盒购自Sigma公司，小牛血清，1640培养基，0.25%胰酶均购自GIBCO公司，TritonX－114购自Amresco公司，芥子酸（SPA）、乙腈（ACN）、三氟乙酸（TFA）、细胞色素C和肌红蛋白均购自Sigma公司。

1.1.3 主要仪器 CO2培养箱由德国Heraeus生产；表面增强激光解吸蛋白飞行时间质谱（SELDITOF－MS）仪、Au蛋白质芯片为Ciphergen公司产品；Vortex－Genie 2涡旋振荡器为美国Scientific Industries公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与收集细胞MDA－MB－231，MCF－7，HBL－100培养于含有10%的小牛血清的RPMI－1640培养基中，细胞贴壁70－90%时传代，加入PBS洗2次，2×107每管冻于－80℃冰箱保存。

1.2.2 膜蛋白蛋白的分离纯化 膜蛋白的分离纯化按照试剂盒说明进行，步骤为：①每管细胞中加入600μl的裂解液，冰浴10min，②4℃×10 000g离心细胞5min，转移上清至以新的管中，③37℃孵育5min，可以观察到液体变为云雾状浑浊。④37℃×3 000g离心3min，弃上清下部沉淀为细胞膜脂筏蛋白和疏水性蛋白。

1.2.3 丙酮沉淀 加预冷丙酮至膜蛋白提取物，－20℃冰箱沉淀过夜，4℃×12 000g离心10min，弃上清重复丙酮沉淀即为膜蛋白，加4‰Tritonx－114充分溶解。

1.2.4 蛋白定量 Olympus AU 2700生化分析仪检测各管中蛋白量，用4‰TritonX－114调节样品浓度为100μg／μl。

1.2.5 质量校准 SELDI－TOF－MS仪每次使用前，采用蛋白标准品胰岛素、细胞色素C和肌红蛋白对SELDI－TOF－MS进行相对分子质量校准，确保系统的质量偏差范围控制在0.1%以内。

1.2.6 SELDI－TOF－MS分析蛋白指纹图谱 10 μl 50%饱和SPA（能量分子，含50%ACN和0.5%TFA）与经过处理的等体积膜蛋白样品混合，上样Au蛋白芯片，每孔4μl，每个标本重复2条芯片，每条2个点，待干后每孔重复加入1μl SPA2次，完全干燥后，选择激光强度为190，灵敏度为8，SELDITOF－MS分析蛋白指纹图谱，Protein－chip Software Bio－maker自动采集数据。

1.2.7 数据收集处理 采用Biomarker Wizard 3.1软件对乳腺癌和正常乳腺细胞线粒体蛋白质分别进行指纹图谱分析，设定有意义的蛋白质峰出现频率阈值为10%，分别设定5，2两次信噪比（S／N）过滤。确定两组间蛋白质峰值比较时，对初步筛选的蛋白质峰进行t检验，以P＜0.05筛选差异蛋白。

1.2.8 溶剂影响 4‰TritonX－114与SPA等量混合，按照1.2.6条件点样分析蛋白指纹图。

1.2.9 长期冻存对结果影响 选择－80℃冻存达3－6个月的细胞，提取膜蛋白分析指纹图谱，与新收集细胞膜蛋白指纹图谱比较，观察两者蛋白峰数目及丰度有无统计学差异。

2 结果

2.1 细胞膜蛋白指纹图谱分析结果

经蛋白指纹图谱标准化后，MDA－MB－231和MCF－7与HBL－100相比，膜蛋白差异点分别为32个和34个（P＜0.05），其中7.8kD，8.3kD和8.8 kD的蛋白在两株癌细胞中表达均降低，9.6kD的蛋白在两株癌细胞中表达均增高，见表1和图1、2。

表1 乳腺正常细胞膜与乳腺癌细胞膜差异蛋白（kD）

图1 分子量7.8kD和8.3kD的差异蛋白指纹图

图2 分子量8.8kD和9.6kD的差异蛋白指纹图

2.2 溶液对结果影响分析

蛋白指纹图谱分析4‰TritonX－114点样Au蛋白芯片后除基质峰外无任何蛋白峰，证明该浓度TritonX－114对结果分析无影响，见图3。

图3 芯片洗涤后点样4‰TritonX－114分析图谱

2.3 长期冻存对结果影响分析

新鲜提取细胞与冻存3－6个月的细胞线粒体蛋白指纹图谱比较，两者在蛋白峰的数量和丰度上均无统计学差异（P＞0.05），表明在此时间范围内保存不影响结果分析，见图4。

图4 新鲜细胞与冻存细胞膜蛋白指纹图谱

3 讨论

细胞膜蛋白约占蛋白总量的1／3，在信号传递，物质转运方面发挥重要的作用，肿瘤细胞膜蛋白连接数量少而且发育差，微绒毛数量增多，一些质膜蛋白如受体蛋白、转运蛋白、黏附蛋白、抗原蛋白等过量表达、缺失或发生修饰，使细胞的信号转导、物质运输、黏附作用、免疫原性等发生改变，与肿瘤细胞的恶性行为如侵袭和转移密切相关。同时膜蛋白是药物作用靶点之一，目前80%临床使用药物的靶点都集中在膜蛋白上，细胞膜蛋白改变时，会引起细胞对药物的反应改变，导致化疗失败。在乳腺癌中，Jensen等［5］研究发现一种以γ－氨基丁酸A型受体为配体的氯离子通道蛋白异常表达。Garcia Pedrero JM［6］等发现AnnexinA1在乳腺癌中表达下调，其下调程度与其上皮分化状态、局部淋巴结转移程度、组织病理学分级密切相关，恶性程度越高，表达下调程度越明显。Adam P J等［7］通过对乳腺癌细胞质膜大规模蛋白质组学分析，建立了500多个的蛋白的乳腺癌细胞质膜蛋白数据集，其中27%功能未知，进一步的定位实验、相互作用分析和免疫组化发现了3个以前未鉴定的蛋白质BCMP11、BCMP84和BCMP101可能在癌变过程中起作用。

SELDI－TOF－MS问世以来，因其分析速度快，相对分子质量范围大，可以有效捕获低分子量、低丰度的蛋白的特点，在亚细胞蛋白研究中得到极大的应用，已通过SELDI－TOF－MS在乳腺癌全细胞蛋白研究中捕获标志物［8］。本实验利用SELDI－TOFMS检测两株乳腺癌及一株乳腺正常上皮细胞株膜蛋白，发现分子量7.8kD，8.3kD和8.8kD的蛋白在两株癌细胞中表达均降低，分子量9.6kD的蛋白在两株癌细胞中表达均增高。同时本实验选择的Au芯片，与以往CM10，WCX等相比，可以重复利用，成本极低，适合大面积筛查。在标本保存时间上，比较－80℃冻存3－6月的细胞膜蛋白与新鲜细胞膜蛋白指纹图谱，发现两者在蛋白峰数目及丰度均无统计学差异，表明在此范围内保存不影响指纹图谱分析，与既往研究一致［9］。提示本实验可用于长期保存标本的研究。

本实验在亚细胞水平初步筛选出了乳腺癌特异性蛋白，但能否将筛选的蛋白用于乳腺癌的诊断，还有很长的路要走。在下一步实验中，我们对差异蛋白分离、纯化和鉴定，同时收集各种类型的临床标本进行验证，以期为乳腺癌标志物研究鉴定更多依据。

［1］Jemal A，Tiwari RC，Murray T，et al.Cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin.2004，54（1）：8.

［2］Chagpar AB，McMasters KM.Trends in mammography and clinical breast examination：apopulation－based study［J］.J Surg Res，2007，140（2）：214.

［3］Hinestrosa MC，Dickersin K，Klein P，et al.Shaping the future of biomarker research in breast cancer to ensure clinical relevance［J］.Nat Rev Cancer，2007，7（4）：309.

［4］Kanzaki A，Yoi M，Nakayama K，et al.Expression of multidrug resistanc－related transporters in human breast carcinoma［J］.J Cancer Res，2001，92（4）：452.

［5］Roberts SS，Mendona－Torres MC，Jensen K.et al.GABA receptor expression in benign and malignant thyroid tumors［J］.Pathol Oncol Res.，2009，15（4）：645.

［6］Garcia Pedrero JM，Fernandez MP，Morgan RO ，et al.Annexin A1down－regulation in head and neck cancer is associated with epithelial differentiation status［J］.Am J Pathol，2004，164（1）：73.

［7］Adam P J，Boyd R，Tyson KL，et al.Comprehensive proteomic analysis of breast cancer cell membranes reveals unique proteins with potential roles in clinical Cancer［J］.J Biol Chem，2003，278（8）：6482.

［8］Mannel F，Medda V，Tonti GA，et al.Protein profile analysis of the breast microenvironment to differentiate healthy women from breast cancer patients［J］.Expert Rev Proteomics，2009，6（1）：43.

［9］Leong S，Christopherson RI，Baxter RC，et al.Profiling of apoptotic changes in human breast cancer cells using SELDI－TOF mass spectrometry［J］.Cell Physiol Biochem，2007，20（5）：579.