李雅蓉，李 兴

近年多项研究表明，在众多脂肪细胞分泌的蛋白和代谢物中，脂联素（ADPN）是唯一提高胰岛素敏感性、对心血管具有保护作用因子。本研究旨在探讨脂联素对高糖环境下心肌细胞凋亡的影响，以揭示脂联素对糖尿病心肌病（DCM）中心肌细胞的可能保护机制，为防治糖尿病心肌病提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料 人心肌细胞株（HCM）购于美国SinceCell公司上海代购，DMEM培养基（美国HyClone公司），胰蛋白酶（北京Solarbio公司），胎牛血清（美国HyClone公司），D-葡萄糖（北京Solarbio公司），MTT试剂盒（美国Sigma公司），脂联素（Human gAcrp美国Pepro Tech公司），Trizol试剂（上海生工生物工程有限公司），FastStart Universal SYRB Green Master（ROX，美 国 Roche 公 司 ）。Bax 引 物，上 游：5′-TTTGCTTCAGGGTTTCATCC-3′；下 游：5′-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3′。Bcl-2引物，上游：5′-GGATGCCTTTGTGGAACTGT-3′；下游：5′-AGCCTGCAGCTTTGTTTCAT-3′。β-actin引物，上游：5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′；下 游：5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′184bp（上海生工生物工程有限公司）。

1.2 人心肌细胞的培养及分组 HCM培养于含10%胎牛血清，5.5mmol／L D-葡萄糖，100U／mL青霉素，100μg／mL链霉素的DMEM培养基中，并置于37℃含5%的CO2的孵箱中孵育，细胞生长至约85%融合时，用0.25%的胰蛋白酶消化传代。正常对照组D-葡萄糖浓度5.5mmol／L；高糖组D-葡萄糖浓度30.0mmol／L；高糖加脂联素组D-葡萄糖浓度30.0mmol／L+ADPN 2.5μg／mL。

1.3 实验方法

1.3.1 MTT法 取部分生长状态佳的细胞，以1×104个／mL接种至96孔板，待细胞贴壁后，改用无血清培养基培养6h。按照实验分组进行干预，每组设3个复孔，同时设凋零孔，分别培养24h、48h、72h后，每孔加入 MTT 20μL，孵育4h后，每孔加入DMSO150μL，振荡10min，待DMSO溶解后，于酶标仪490nm处测得吸光度OD值。

1.3.2 流式细胞术 取部分生长状态佳的细胞，以1×105个／mL接种至6孔板，待细胞贴壁后，改用无血清培养基培养6h，使细胞同步化，弃去培养液，按照实验分组进行干预，每组设3个复孔，分别培养24h、48h、72h，用脂结合蛋白AnnexinV／碘化丙啶（PI）双染色标记后，流式细胞仪测细胞的凋亡百分率。……