张 慧，王 雄，黄宏亮，杨 柳

心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）是冠心病实验研究的热点课题。有关腺苷对心肌缺血-再灌注损伤的保护作用已有文献报道，体现在其舒张冠状动脉、抑制凋亡、减轻炎性反应等方面［1］。而腺苷作用于热休克蛋白70（heat shock protein，HSP70）进而干扰细胞凋亡程序来发挥抗心肌缺血再灌注损伤的有关文献报道较少。本课题拟建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，阐明腺苷后处理对缺血再灌注损伤后心肌组织HSP70表达及心肌细胞凋亡的影响，进一步探讨腺苷保护心肌缺血-再灌注损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 健康清洁级成年雄性Wistar大鼠24只，体重（230±30）g，由山西医科大学生理实验室提供。腺苷购自美国Sigma公司，生理盐水按比例溶解稀释。小鼠抗大鼠HSP70单克隆抗体、SABC免疫组化试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司，Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，PCR引物购自上海生工生物工程有限公司。

1.2 动物模型制备 大鼠术前12h禁食不禁饮，腹腔注射25%乌拉坦（4mL／kg）麻醉后，气管插管，微型动物呼吸机辅助呼吸，针形电极插于四肢皮下记录Ⅱ导联心电图，开胸暴露心脏，左心耳下缘2cm处，以1.0mm～1.5mm深度进针穿线（6-0丝线），套管夹毕法结扎左冠状动脉前降支（LAD）。以结扎后心电图ST-T抬高，放松后ST-T回落50%为造模成功标准。

1.3 动物分组与给药 24只健康雄性Wistar大鼠按体重从小到大依次编号，用随机数字表法分为假手术组（Sham组）、缺血再灌注组（I／R组）、腺苷后处理组（AD组），每组8只。Sham组：只穿线不结扎，麻醉150min；I／R组：结扎30min，再灌注120min；AD组：结扎30min，于结扎25min时股静脉微量注射泵给药5min［305μg（kg·min）］，之后再灌注120min。Sham组和I／R组均于前述注射腺苷相同时间点于股静脉给定量生理盐水，5min内输注完作为平衡对照。术中大鼠死亡剔除，再随机补充。

1.4 标本制备 各组大鼠于实验终点迅速剪取心脏，冰生理盐水冲洗后，剪取左心室缺血区心肌组织，其中随机取各组中两只大鼠心肌100mg，迅速于-80℃冰箱冻存，余心肌组织置于10%甲醛液中保存48h。固定脱水，石蜡包埋，连续切片，片厚2μm，60℃烤片备用。每个心肌组织标本切片两份，分别进行TUNEL及HSP70免疫组化染色。

1.5 指标检测

1.5.1 TUNEL法检测心肌细胞凋亡 严格按照试剂盒说明书完成操作，每张切片于250倍光镜下随机计数5个非重复视野阳性细胞数（胞核呈棕黄色颗粒）及心肌细胞总数，计算心肌细胞凋亡率。

1.5.2 免疫组织化学染色 切片常规脱蜡、过氧化氢孵育、高压抗原修复，滴加1∶100的HSP70抗体，放入4℃冰箱过夜、滴加生物素标记的二抗、再滴加辣根酶标记链霉卵白素、DAB显色、脱水、复染、封片。每张切片于250倍光镜下随机拍取5个非重复视野，以细胞浆／核呈棕黄色颗粒视为HSP70蛋白表达阳性，BI-200图像分析系统分析平均光密度值。

1.5.3 荧光实时定量PCR检测组织microRNA-1表达 取50 mg心肌组织，Trizol法提取总RNA，紫外吸收测定法检测RNA纯度，变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量，再进行反转录成cDNA，Realtime PCR仪进行PCR检测，以U6作为内参，microRNA-1的 上 游 引 物 是 5′GGGGTGGAATGTAAAGAAG3′，下游引物是5′TGCGTGTCGTGGAGTC3′。内参U6的上游引物是5′GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3′，下 游 引 物 是 5′CGCTTCACGAATTTG CGTGTCAT3′，数据采用2-△△Ct法进行计算。

1.6 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件分析，数据用均数±标准差（x±s）表示，组间比较行单因素方差分析，两两比较用SNK-q检验法。

2 结 果

2.1 TUNEL检测结果 Sham组偶见凋亡细胞；I／R组可见大量凋亡细胞，呈弥漫性分布；AD组凋亡细胞率明显低于I／R组（P＜0.05），但高于Sham组（P＜0.05）。详见表1。

2.2 HSP70免疫组化结果 光镜下，Sham组存在少量HSP70胞质表达；I／R组HSP70表达升高，且可见部分胞核表达；AD组HSP70大量表达于胞质，表达量显著升高，且高于I／R组（P＜0.05）。详见表1。

表1 各组HSP70蛋白表达及细胞凋亡率比较（x±s）

2.3 心肌组织microRNA-1表达 与Sham组相比，I／R组microRNA-1表达水平升高，为原来的4.4 2倍，AD组micro RNA-1表达水平升高，为原来的2.06倍。与I／R组相比，AD组microRNA-1表达水平降低，为原来的2.15倍。

3 讨 论

心肌缺血再灌注损伤是冠心病治疗的重要课题，如何防治MIRI已成为现今研究的重点内容。腺苷作为一种重要的内源性活性保护物质，可以通过多种途径保护心肌缺血再灌注损伤，如舒张冠状动脉，减轻再灌注心肌的钙超载，抑制血小板聚集，减少氧自由基释放，减轻炎性反应，减轻凋亡及减少心肌梗死范围等。研究发现［2］，腺苷受体可以触发缺血后适应，对缺血再灌注产生保护作用。另有研究发现［3］，腺苷后处理通过调节Bcl-2及Bax蛋白的表达，从而减轻MIRI引起的心肌细胞凋亡。

心肌缺血再灌注损伤作用机制极为复杂，目前大多认为其造成的细胞损伤形式有两种，即死亡和凋亡，其中细胞凋亡占重要地位。1994年，Gottlieb等［4］首先在兔心脏上发现再灌注损伤促进了细胞凋亡。目前有关研究表明细胞凋亡机制主要有氧自由基学说、钙超载、线粒体损伤等，而信号转导途径研究多集中在死亡受体途径、内质网途径和线粒体途径。

心肌缺血再灌注损伤后引起了一系列应激反应，诱导一些特殊基因表达合成增加，HSP70就是其中之一。目前认为HSP70对缺血再灌注损伤的心肌细胞具有保护作用，HSP70可充当分子伴侣的角色，帮助新合成的蛋白质正确的折叠、解聚、转运，以及结合受损的蛋白质或多肽，使其修复或通过泛素／蛋白酶体使其降解，从而防止了随后的细胞生命信息紊乱，如通过对氧化应激诱发的变性的凋亡抑制蛋白（Bcl-2等）加以修复或阻止其降解，从而恢复其凋亡抑制作用。HSP70还可以减轻钙超载，保护血管内皮细胞的功能，阻碍应激诱发的细胞凋亡程序来抗缺血再灌注损伤。HSP70可以从多个环节阻断凋亡信号分子而抑制细胞凋亡，其能阻断JNK依赖的线粒体途径［5］，抑制磷酸化抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL［6］，从而抑制细胞色素C从线粒体释放，减少细胞凋亡。HSP70还能通过阻断位于线粒体的凋亡诱导因子AIF的核移位，而发挥HSP70的抗凋亡功能［7］。

新近研究发现，microRNA-1在促进心肌细胞凋亡方面发挥着重要作用。Yang等［8］研究表明，心肌特异性microRNA-1的表达水平在缺血心肌中显著提高。同时Xu等［9］研究发现，心肌特异性microRNA-1在氧化应激大鼠心肌模型中，micro RNA-1抑制了靶蛋白HSP70的表达，促进了心肌细胞凋亡，但未对HSP70的转录水平造成影响。另一研究表明［10］，在心肌缺血再灌注模型中心肌特异性microRNA-1的表达与心肌抗凋亡蛋白Bcl-2的表达呈显著负相关。

本实验研究发现，Sham组microRNA-1及HSP70蛋白均有少量表达，并有少量细胞凋亡，I／R组microRNA-1及HSP70蛋白表达增加，并伴有细胞凋亡的增加，提示microRNA-1及HSP70蛋白参与了心肌缺血再灌注损伤所致细胞凋亡的过程，这于国内外研究报道基本一致。与I／R组相比，AD组心肌组织microRNA-1表达下调，HSP70蛋白表达明显上调，心肌细胞凋亡明显减少，说明腺苷后处理可能通过抑制micro RNA-1表达，进而促进靶蛋白HSP70表达，阻断下游凋亡信号分子而减轻细胞凋亡，从而达到心肌保护的作用。由于本实验检测腺苷后处理对microRNA-1表达影响的例数较少，尚需要进一步大样本实验研究证实。本实验进一步验证了腺苷后处理再灌注心肌的心肌保护作用，为研究其作用机制提供了新思路。

［1］ Canyon SJ，Dobson GP.Protection against ventricular arrhythmias and cardiac death using adenosine and lidocaine during regional ischemia in the in vivo rat［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004，287（3）：H1286-H1295.

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［3］ Zhao ZQ，Budde JM，Morris CD，et al.Adenosine attenuates reperfusion-induced apoptotic cell death by modulating expression of Bcl-2and Bax proteins［J］.J Mol Cell Cardiol，2001，33：57-68.

［4］ Gottlieb RA，Burleson KO，Kloner RA，et al.Reperfusion injury induces apoptosis in rabbit cardiomyocytes［J］.J Clin Invest，1994，94（4）：1621-1628.

［5］ Kumar Y，Tam U.Stress protein flux during recovery form simulated ischemia induced heat shock protein 70confers cytoprotaction by suppressing JNK activation and inhibiting apoptotic cell death［J］.Proteomics，2003，3（4）：513-526.

［6］ Fan M，Goodwin M，Vu T，et al.Vinblastine-induced phosphorylation of Bcl-2and Bcl-XL is mediated by JNK and occurs in parallel with inactivation of the Raf-1／MEK／ERK cascade［J］.J Biol Chem，2000，275（39）：29980-29985.

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［8］ Yang B，Lin H，Xiao J，et al.The muscle-specific microRNA miR-1regulates cardiac arrhythmogenic by targeting GJA1and KCNJ2［J］.Nature Medicine，2007，13（4）：486-491.

［9］ Xu C，Lu Y，Pan Z，et al.The muscle-specific microRNAs miR-1 and miR-133produce opposing effects on apoptosis by targeting HSP60，HSP70and caspase-9in cardiomyocytes［J］.J Cell Sci，2007，120（Pt 17）：3045-3052.

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