吴 春 陈林林 李俊生

(哈尔滨商业大学食品工程学院省高校食品科学与工程重点实验室，哈尔滨 150076)

黑大豆种皮花色苷对亚硝胺体内外合成的阻断作用

吴 春 陈林林 李俊生

(哈尔滨商业大学食品工程学院省高校食品科学与工程重点实验室，哈尔滨 150076)

在模拟人体胃液的条件下，通过测定N－二甲基亚硝胺(NDMA)的阻断率、NO2－的形成量和清除率，研究了黑大豆种皮花色苷(BSCA)体外对亚硝化反应的抑制活性;以血清谷丙转氨酶为测定指标，通过动物试验考察了BSCA体内对亚硝胺合成的阻断作用。结果表明，BSCA能明显阻断亚硝胺的化学合成，其最大阻断率为85.9%，对亚硝酸钠具有较好的清除活性，最大清除率为70.4%;其对硝酸盐还原酶还原NO3－为NO2－的抑制率可达53.7%。体内阻断亚硝胺合成的实验中，BSCA组血清谷丙转氨酶显著低于对照组(P＜0.01)。BSCA对亚硝胺的体内外合成均具有较强的阻断作用。

黑大豆种皮 花色苷 亚硝胺 阻断作用 体内外

N－亚硝胺(NDMA)是一类强致癌物，它能引起人和动物胃、肝脏等多种脏器的恶性肿瘤。正常情况下人们直接从食物中摄入亚硝胺的量微乎其微，但形成NDMA类的前体物质硝酸盐或亚硝酸盐却广泛存在于食物及产生于食物在体内的代谢过程中，特别是亚硝酸盐在胃液中更易合成NDMA［1－3］。因此，阻断NDMA合成和清除其前体亚硝酸盐是防癌抗癌的有效途径。

黑大豆是传统的药食兼用的农产品资源，其种皮富含花色苷类化合物，是天然色素的重要来源。目前对黑大豆种皮花色苷(black soybean coat anthoc－yanin，BSCA)的研究多集中在化学结构、稳定性、抗氧化、清除自由基等方面［4－8］，而对亚硝化反应的抑制活性方面的研究却鲜有报道。本试验以黑大豆为原料提取花色苷，研究其体内外清除亚硝酸钠及对亚硝胺合成的阻断作用，为寻找安全有效且具有较高食用和药用价值的亚硝化反应抑制剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

黑大豆种皮:市售黑龙江省绥化市产黑大豆，手工剥取种皮，干燥后粉碎过60目筛，备用。

昆明种小鼠:由黑龙江省肿瘤研究所实验动物中心。

氨基比林:锦州九州药业;谷丙转氨酶试剂盒:南京建成生物工程研究所;硝酸盐还原酶提取液:实验室自制;醋酸锌、无水乙醇等试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

721紫外可见分光光度计:上海光谱仪器有限公司;XT220A电子天平:瑞士普利塞斯;W202B升降恒温水浴锅:上海申胜生物技术有限公司;PHS－25型酸度计:上海伟业仪器厂;UV－VI紫外透射分析仪:北京智源通生物技术研究所。

1.3 试验方法

1.3.1 黑大豆种皮花色苷的制备

取一定量黑大豆皮，按料液比为1∶30(g/mL)加入60%(体积分数)的乙醇溶液混合均匀，用0.5 mol/L HCl将溶液pH调至3，在70℃浸提1 h，过滤，收集滤液;将滤渣按同样的条件重复浸提2次过滤，合并3次滤液于50℃下减压浓缩得到棕红色黏稠的粗提液。粗提液用AB－8大孔树脂分离纯化，上样pH值为1，上样量与树脂的体积比为8∶1，按1 mL/min的流速上柱，静置50 min后，采用70%的乙醇溶液作为洗脱剂，洗脱液量与树脂体积比为8∶1。洗脱物经真空冷冻干燥成粉，试验前用双蒸水配成所需浓度。

1.3.2 体外阻断NDMA合成的浓度梯度试验

在模拟人体胃液的条件下，二甲胺与亚硝酸钠在37℃条件下，可适宜地生成二甲基亚硝胺，当往BSCA中依次加入二甲胺与亚硝酸钠时，BSCA优先同亚硝酸钠作用，使得二甲胺不能与亚硝酸钠反应，达到阻止亚硝胺生成的目的。据此可以比较相同条件下生成亚硝胺量的多少来反映BSCA阻断能力的强弱，生成亚硝胺量少，阻断能力就强，反之则弱。

在紫外光照射下，二甲基亚硝胺可分解成二甲基仲胺和亚硝酸根，亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮化后，再与α－萘胺偶合生成红色化合物。用分光光度计测出该化合物的吸光度值可计算上述反应液中亚硝胺含量的多少。

精确称取BSCA 0.1 g用少量蒸馏水溶解，定容至100 mL，质量浓度为0.001 g/mL，作为测试液。

准确吸取 BSCA 测试液各 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3、3.5、4.0 mL 于 25 mL 比色管中，分别加入 pH 3.0的柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液5 mL，1 mmol/L NaNO2溶液 0.5 mL，再加入 1 mmol/L二甲胺0.5 mL，用蒸馏水定容至刻度，在37℃下恒温1 h。用移液管吸取1.0 mL上述反应液到70 mm的培养皿中，加入0.5%的 Na2CO3溶液0.5 mL，于黑布遮盖的紫外分析仪上照射15 min，取出后加入1%的对氨基苯磺酸和0.1%的a－萘胺溶液各1.5 mL，加水至溶液精确体积为5.0 mL，然后摇匀放置15 min后，用分光光度计在525 nm处测吸光度值(Ax)，同时做空白试验(A0)，计算阻断率。

阻断率=(A0－Ax)/A0×100%

1.3.3 体外清除NaNO2的浓度梯度实验

亚硝酸盐在弱酸性的条件下，能与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合生成红色的化合物。准确吸取 BSCA 测试液各 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3、3.5、4.0 mL 于 25 mL 比色管中，分别加入5 mg/L的 NaNO2标准液 2.0 mL，pH 3.0 的柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液5 mL，用蒸馏水定容至刻度，在37℃下恒温1 h。用移液管吸取1.0 mL反应溶液到70 mm的培养皿中，加入 0.4%对氨基苯磺酸2.0 mL，摇匀静置5 min，再加入0.2%盐酸萘乙二胺1.0 mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀静置15 min。在确定的最大吸收波长λmax=540 nm处测定吸光度(Ax)，同时做空白试验(A0)，计算清除率。

清除率=(A0－Ax)/A0×100%

1.3.4 抑制硝酸盐还原酶还原NO－3为NO－2试验

取 0.001 g/mL BSCA 测试液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3、3.5、4.0 mL 和 1.0 mol/L 的硝酸钠1.0 mL分别加入25 mL比色管中，用蒸馏水补充至9.0 mL，再加入1.0 mL硝酸盐还原酶提取液后放入37℃水浴锅中反应30 min，取出立即加入0.8%对氨基苯磺酸1.0 mL，0.5% α － 萘胺 1.0 mL，室温下反应15 min后比色，测定吸光度，按绘制的NaNO2标准曲线(c=8.251 8 A －1.347 7，R=0.995。式中:c为亚硝酸钠溶液的浓度/μg/mL;A为吸光度值;R为相关系数)计算NO－2的形成量，并以此来计算其抑制率。

抑制率IR=(N空－N样)/N空

式中:N空、N样分别为未加入BSCA和加入BSCA的NO－2的形成量。

1.3.5 体内阻断亚硝胺合成试验

健康68周龄小鼠，体重18～22 g，雌雄各半，适应环境喂养一周后按体重随机分成正常组，对照组，BSCA高、中、低剂量组，每组10只。对照组灌胃亚硝酸钠和氨基比林混合液10 mL/(kg·d)(10 mL内含27.3 mg 亚硝酸钠和 81.9 mg氨基比林)，BSCA高、中、低剂量组灌胃亚硝酸钠和氨基比林和不同量的BSCA的混合液10 mL/(kg·d)，正常组灌胃同体积0.9%生理盐水，每天灌胃一次，共5 d，第6天摘取眼球取血，2 500 r/min离心20 min分离制备血清，用赖氏法在505 nm下测定血清中谷丙转氨酶的含量。

2 结果分析

2.1 黑豆皮花色苷的提取及纯化后得率

由20 g黑豆皮粉末按1.3.1方法对黑豆皮中花色苷进行提取及纯化，经真空旋转浓缩，真空干燥后分别得酒红色粉末，测定粉末质量，计算出提取及纯化后黑豆皮花色苷的得率见表1。

表1 黑豆皮花色苷得率

2.2 体外对NDMA合成的阻断作用

BSCA体外对NDMA合成的阻断作用结果见图1。

图1 BSCA对NDMA合成的阻断作用

由图1可以看出，BSCA对NDMA合成具有明显的阻断作用，随着样液浓度的增加，BSCA对NDMA合成的阻断率出现明显的梯度变化，当加样量在0.5 ～2.5 mL 时，阻断率由 44.2%上升至 74.6%，随着加样量的增加其作用增强，当加入量达到3 mL后，阻断能力基本不变。说明BSCA可有效地阻断亚硝胺的合成。最大阻断率可达85.9%，出现在加样量为4 mL处。

2.3 体外对亚硝酸钠的清除作用

BSCA体外对NaNO2的清除作用结果见图2。

图2 BSCA对NaNO2的清除作用

由图2可以看出，BSCA对NaNO2的清除作用效果与其浓度成正相关关系。随BSCA取样量的增加，其对亚硝酸钠的清除率逐渐增加，当加样量达到2.5 mL后，再继续增加BSCA，清除率变化很小。这时清除率最大可达70.4%，说明BSCA可有效地清除亚硝酸钠。

2.4 抑制硝酸盐还原酶还原NO－3为NO－2试验

食物中硝酸盐在人体内经存在于胃液内的多种硝酸盐还原菌(含有硝酸盐还原酶)作用转变成亚硝酸盐，从而成为在体内形成亚硝胺的前体物质。试验结果表明BSCA具有抑制硝酸盐还原酶还原NO－3为NO－2的作用，结果见图3。

图3 BSCA对硝酸盐还原酶还原NO－3为NO－2的抑制作用

由图3可以看出，在BSCA添加量在0.5～3.5 mL范围内时，随着BSCA加入量的增大，对硝酸盐还原酶还原NO－3为NO－2的抑制率逐渐增大。随后增大加入量抑制率不再改变，其最大抑制率为53.7%。

2.5 体内对NDMA合成的阻断作用

以血清谷丙转氨酶为指标测定，考察BSCA体内阻断NDMA合成的作用效果，结果见表2。

由表2数据可知，给药组血清谷丙转氨酶较对照组明显降低，其中高剂量组血清谷丙转氨酶接近正常组，且BSCA的浓度与血清谷丙转氨酶的量存在剂量效应关系。

表2 黑大豆种皮花色苷体内阻断N－二甲基亚硝胺合成的效果(x±s，n=10)

3 讨论与结论

通过对BSCA体内外抑制亚硝化反应的活性研究，表明BSCA能清除亚硝酸钠、阻断亚硝胺的合成和明显降低血清谷丙转氨酶含量。由于在体内酸性环境中，亚硝酸盐与仲胺合成亚硝胺，亚硝胺通过血液循环进入肝细胞中，破坏肝细胞，致使肝组织中的谷丙转氨酶进入血液中。而BSCA正是通过清除亚硝酸盐来阻断亚硝胺的合成，从而起到保护肝组织免受亚硝胺的侵害，降低血清谷丙转氨酶的作用。黑大豆资源丰富，研究其在防癌方面的作用具有较好的开发应用前景。

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Inhibition of Nitrosamine Synthesis by Black Soybean Coat Anthocyanin in Vivo and Vitro

Wu Chun Chen Linlin Li Junsheng
(Key Laboratory of Food Science and Engineering，College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076)

The activity of black soybean coat anthocyanins(BSCA)on inhibiting nitrosation was studied by measuring the blocking rate on synthesis of N－nitrosodimethylamine，formation rate and clearance rate of NO2and providing simulated test human gastric juice conditions.The in vivo activity of blocking synthesis of nitrosamine was investigated by taking animal experiment，and taking serum GPT as a test index.The results showed that BSCA had obvious capability of blocking chemical nitrosamine synthesis.The maximum blocking rate of NDMA was 85.9%，the activity of scavenging sodium nitrite was relatively good.The maximum eliminating rate of nitrite sodium was 70.4%.BSCA can prohibit 53.7%of the reducing of nitrate reductase(from NO3－to NO2－).During the process of blocking synthesis of nitrosamine，the serum GPT in BSCA group was significantly lower than that in control group(P ＜0.01).BSCA has strong inhibiting effect on blocking nitrosamine synthesis in vivo and vitro.

black soybean coat，anthocyanin，nitrosamine，inhibition，vivo and vitro

TS202.3

A

1003－0174(2012)01－0025－04

黑龙江省教育厅科学技术研究重点项目(12511z010)

2011－04－07

吴春，女，1962年出生，教授，食品化学