刘彩红，李玉琴，*，李 珂，贾宝秀，郭玉蓉

（1.泰山医学院药学院，山东泰安271000；2.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062）

流动注射化学发光测定苹果多酚抗氧化活性

刘彩红1，李玉琴1，*，李 珂1，贾宝秀1，郭玉蓉2

（1.泰山医学院药学院，山东泰安271000；2.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062）

用流动注射化学发光法测定苹果多酚的体外抗氧化作用。将苹果多酚提取液加入3种化学发光体系，测量其发光强度，根据系统化学发光被抑制的程度评价苹果多酚对活性氧自由基的清除能力，并以抗坏血酸（VC）为阳性对照。结果表明，苹果多酚对三种活性氧自由基（O2-·、·OH、H2O2）的清除能力远强于VC；对H2O2和·OH的清除能力相当，强于对O2-·的清除能力。结果显示苹果多酚具有很好的抗氧化能力。

流动注射化学发光，苹果多酚，抗氧化

多酚类物质是苹果中重要的生物活性成分之一，由于能影响苹果汁的颜色、风味，如苦涩味、收敛性等而倍受关注。其主要成分为类黄酮类化合物，具有抗癌、抑制高血压和高血脂、抑菌[1-3]等多种药理功能。研究表明，多酚类物质具有较好的抗氧化能力，因此本实验采用流动注射化学发光法对苹果中多酚类物质清除活性氧自由基（O2-·，·OH，H2O2自由基）的能力进行了快速体外筛选，并将其与维生素C（VC）的清除能力进行对比，为苹果采后加工工艺过程中多酚类物质的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红富士苹果 烟台；鲁米诺 sigma公司；福林酚试剂 北京索莱宝科技有限公司，1mol·L-1，避光冷藏；没食子酸、邻苯三酚、维生素C、无水乙醇、铁氰化钾、过氧化氢等试剂 均为分析纯；实验用水 均为二次蒸馏水。

IFFM-D型流动注射化学发光分析仪 西安瑞迈科技有限公司；UV-2450PC紫外可见分光光度计 日本岛津公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制 邻苯三酚溶液用lmmol·L-1的HCl溶液配制，使用前用二次蒸馏水稀释至所需浓度，鲁米诺用0.lmol·L-1的NaHCO3-Na2CO3缓冲溶液配制成所需浓度；亚铁氰化钾、鲁米诺以及H2O2均用KH2PO4-NaOH（pH7.20）缓冲溶液配制，使用前配制。

1.2.2 苹果多酚的提取[4]红富士苹果清洗后，切块，加0.1%异VC，破碎后精确称取10g样品于带塞锥形瓶中，按料液比1∶6加入60%的乙醇，超声波提取20min，然后抽滤，所得滤液经旋转蒸发浓缩后，离心20min，转速3000r·min-1，取其上清液备用。

1.2.3 苹果多酚含量测定

1.2.3.1 标准曲线的绘制 准确称取25mg没食子酸，用50%甲醇定容至50mL，然后配制0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15mg·mL-1的标准溶液，分别准确吸取不同浓度的标准溶液lmL，加入1mL Folin-Ciocalteu试剂，充分混匀后加入10mL 7%碳酸钠溶液，用蒸馏水定容至25mL，不时振荡，2h后，在768nm下测吸光度，以50%甲醇作空白。以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标作图，进行曲线拟合得标准曲线方程：A=0.1109+ 0.1523C（r=0.9918）。

1.2.3.2 样品总酚含量测定 准确吸取1mL样品液，置25mL容量瓶中，按照标准曲线项制备方法测定。根据标准曲线方程计算，得样品液中总酚含量为29.2mg·L-1。

1.2.4 流动注射化学发光 按图1设计的流动注射化学发光分析流路，蠕动泵分别泵入a邻苯三酚溶液、b鲁米诺-碳酸盐缓冲液和c H2O（·OH体系中，蠕动泵分别泵入鲁米诺、亚铁氰化钾溶液以及H2O2溶液；H2O2自由基体系中分别泵入H2O2、鲁米诺-碳酸盐缓冲液和H2O），分别在混合器中混合并发生反应，记录发光信号。当蠕泵中进的是空白溶液时，发光信号为空白值I0，当进的是待测液或VC溶液时，发光信号记为IT，根据发光信号的降低值（I0-IT），可以定量分析苹果多酚与维生素C清除自由基的能力。自由基抑制率为：

以发光抑制率为纵坐标，样品浓度为横坐标，绘出发光抑制曲线，并计算自由基抑制率为50%时的浓度IC50，用来衡量样品对自由基的清除能力。IC50值越小，表明样品清除自由基能力越强[5]。

图1 流动注射化学发光示意图Fig.1 Flowchat of flow injection chemiluminescence

1.2.5 O2-·清除能力检测 采用邻苯三酚－碳酸盐缓冲溶液－鲁米诺体系测定，邻苯三酚在碱性条件下自氧化产生O2-·，O2-·与化学发光增效剂鲁米诺反应，使之氧化，产生一个电子激发态的中间物，当其返回基态时，可发出化学冷光，用发光检测装置即可测定发光强度。反应体系中O2-·的量可以用化学发光强度来相对表示。测定中，选择邻苯三酚：0.25mmol·L-1；鲁米诺：0.4mmol·L-1；NaHCO3-Na2CO3缓冲溶液pH：9.95，此时体系的发光强度、稳定性及重现性较好。

1.2.6 ·OH清除能力检测 ·OH由Fe2+催化的Fenton体系产生，鲁米诺为发光增效剂，采用亚铁氰化钾-鲁米诺-H2O2体系测定。根据反应物和鲁米诺的浓度对化学发光强度、稳定性以及重现性的影响，本实验选择亚铁氰化钾：0.26mmol·L-1；鲁米诺：0.1mmol·L-1；H2O2含量：0.2%。

1.2.7 H2O2清除能力检测 采用鲁米诺-过氧化氢碳酸盐缓冲溶液体系测定，碱性条件下，过氧化氢氧化鲁米诺使之发光，其发光强度与过氧化氢含量成正比，发光强度的下降可以体现样品清除过氧化氢的能力。实验中H2O2含量：0.3%；鲁米诺：0.2mmol·L-1；NaHCO3-Na2CO3缓冲溶液pH：9.60。

2 结果与分析

2.1 对O2-·的清除作用

根据上述条件，分别对空白溶液、苹果多酚提取液及VC溶液进行化学发光强度测定，每个体系重复测定3次，发光强度取平均值。

图2 苹果多酚对发光强度的影响Fig.2 Effect of apple polyphenols on chemiluminescence intensity

图2所示为苹果多酚提取液对O2-·体系发光强度的影响，由此看出苹果多酚能够降低该体系的发光强度，发光强度降低即表示反应物对O2-·具有抑制能力，说明苹果多酚对O2-·具有一定的清除作用。

图3 VC和苹果多酚对O2-·的清除作用Fig.3 The scavenging ability on O2-·of VCand apple polyphenols

配制不同浓度的苹果多酚和VC溶液进行测定，并计算发光抑制率，绘制发光抑制率曲线如图3。由图可见，在实验范围内，苹果多酚提取液和VC对O2-·的清除作用均随浓度增大而增大。相同条件下，苹果多酚提取液对O2-·的清除作用明显强于VC，二者的IC50分别为0.47、1.50mg·L-1。

2.2 对·OH的清除作用

测定不同浓度的苹果多酚和VC溶液对·OH体系发光强度的影响，计算发光抑制率，并绘制发光抑制率曲线如图4。

图4 VC和苹果多酚对·OH的清除作用Fig.4 Thescavengingabilityon·OHofVCand applepolyphenols

由图4可知，苹果多酚和VC对·OH有较好的清除作用，且在实验范围内清除率随浓度增大而增大。相同条件下，苹果多酚提取液对·OH的清除作用强于VC，IC50分别约为0.20、0.54mg·L-1。

2.3 对H2O2的清除作用

测定不同浓度的苹果多酚和VC溶液对H2O2系发光强度的影响，计算发光抑制率，并绘制发光抑制率曲线如图5。由图5可知，苹果多酚对H2O2有很好的清除作用，且在实验范围内呈明显的量效关系。相同条件下，苹果多酚对H2O2的清除能力远高于VC，二者IC50分别约为0.21、1.81mg·L-1。

图5 VC和苹果多酚对H2O2的清除作用Fig.5 The scavenging ability on H2O2of VCand apple polyphenols

本实验通过将苹果多酚与VC进行对比可知：苹果多酚提取物具有很好的清除活性氧自由基的作用，对O2-·、·OH、H2O2三种自由基的清除能力远强于VC。由IC50值（见表1）可知，苹果多酚提取物对H2O2、·OH的清除能力相当，强于对O2-·的清除能力。

表1 苹果多酚和VC的抗氧化活性Table 1 Antioxidation of apple polyphenols and VC

3 讨论

研究表明，多酚物质的抗氧化活性与其环结构上羟基的位置和数目有密切的关系。苹果多酚提取物中的主要成分为绿原酸和黄烷醇类物质，均为多羟基取代的苯环，苯环上电子的离域作用使酚羟基容易离子化，是很好的氢供体。苹果多酚提取物中含有大量的这种供体基团，具有很强的提供氢质子的能力，能使具有高度氧化性的自由基还原，能够终止自由基链式反应，阻止新的自由基的产生。另外，苹果多酚提取物是一个复杂的多种酚类物质的混合物，因此不排除其中的单一物质之间的相互作用，但对苹果多酚提取物中不同酚类物质之间的相互协同作用或拮抗作用还需作进一步研究。

[1]王宏.苹果渣中多酚物质的提取、分离及其抗氧化活性研究[D].西安：陕西师范大学，2006.

[2]牛鹏飞，仇农学，杜寅.苹果渣中不同极性多酚的分离及其体外抗氧化活性研究[J].农业工程学报，2008，24（3）：238-242.

[3]孙红男，孙爱东，苏雅静.苹果多酚抑菌效果的研究[J].北京林业大学学报，2010，32（4）：280-284.

[4]金莹，孙爱东，崔莉.苹果多酚超声波提取条件的优化研究[J].食品工业科技，2005（12）：99-102.

[5]刘荣华，余伯阳，邱声祥，等.山楂叶中多元酚类成分抗超氧阴离子活性研究及构效关系[J].中国药学杂志，2005，40（14）：1066-1069.

Determination of antioxidation of apple polyphenols by flow injection chemiluminescence

LIU Cai-hong1，LI Yu-qin1，*，LI Ke1，JIA Bao-xiu1，GUO Yu-rong2
（1.Pharmacy Department of Taishan Medical University，Tai'an 271000，China；2.College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi'an 710062，China）

The purpose was to determine the scavenging ability on ROS free radical of apple polyphenols in vitro by flow injection chemiluminescence.The determination was based on the inhibition effect of apple polyphenols extraction in three chemiluminescence system，and vitamin C was used as positive control.It was showed that apple polyphenols original liquid can inhibit and clear the ROS such as O2-·，·OH and H2O2effectively，and the scavenging ability was better than vitamin C.The scavenging ability of apple polyphenols on H2O2was much better than O2-·，but was equal to·OH.Conclusion was the apple polyphenols extraction was an excellent natural antioxidant.

flow injection chemiluminescence；apple polyphenols；antioxidation

TS255.1

A

1002-0306（2012）01-0128-03

2010－12－17 *通讯联系人

刘彩红（1976－），女，硕士，讲师，主要从事药物分析的研究和教学工作。

农业部现代苹果产业技术体系-苹果采后加工技术研究（Nycytx-08）。