毛张凡， 徐小惠， 黄 杰， 耿 庆， 康敢军

(1武汉大学人民医院胸外科，湖北武汉430060;2华中科技大学同济医院药剂科，湖北武汉430030)

肺癌是人类发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。尽管肺癌的治疗手段日新月异，但其5年生存率经多年研究仍无明显改善。肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)学说的提出为癌症治疗带来了新的曙光。有研究表明干细胞中存在多种离子通道电流，如大鼠骨髓间质干细胞、大鼠胚胎干细胞和小鼠心脏干细胞中均存在不同类型的离子通道电流［1－4］。研究显示容积激活氯通道(volume－activated chloride channel，VACC)与肿瘤的发生发展关系密切。其参与肿瘤细胞增殖、迁移、凋亡并与肿瘤的多药耐药性密切相关［5－6］。但目前对VACC和肿瘤关系的研究均限于已分化肿瘤细胞。因此本实验观察CSCs中是否存在VACC，为进一步研究其在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。

材料和方法

1 细胞分选、培养及纯度测定

肺癌细胞系A549(购自上海研吉生物科技有限公司)用含10%胎牛血清(Gibco)的RPMI－1640培养基(Gibco)培养，细胞传代和收集均采用0．25%胰酶消化进行。采用免疫磁珠分选(magnetic cell separation，MACS)法分离肺癌细胞系A549中的CD133+和CD133－细胞，MACS体系为Miltenyi产品。取对数生长期的肺癌细胞系A549细胞108个，离心后重悬于400μL磁珠分选缓冲液中，加入100μL FcR封闭剂。制成单细胞悬液后与100μL CD133磁珠避光4℃孵育30 min。加入5 000 μL buffer，300×g离心10 min，洗涤细胞。用500μL MACS缓冲液重悬细胞。将磁分选MS柱放入磁分选器，加入500μL MACS缓冲液洗柱2次，加入细胞悬液，未与磁珠结合的CD133－细胞随缓冲液流出。500μL MACS缓冲液冲洗吸附柱3次。将MS柱移出分离器，1 000μL磁珠分选缓冲液冲洗即获得纯化的CD133+细胞。……