陈兴无， 左 蓓， 张新红

(皖南医学院弋矶山医院呼吸内科，安徽芜湖241001)

气道炎症和重塑是哮喘患者的基本病理特征，其程度与疾病严重度呈正相关;在慢性炎症条件下，气道壁成纤维细胞活化并转分化为表达α－平滑肌肌动蛋白(α －smooth muscle actin，α －SMA)、具收缩功能且分泌活跃的肌成纤维细胞［1］。哮喘反复发作促进气道炎症和重塑，已知病毒感染是急性发作最常见的诱因［2］，其中鼻病毒(rhinovirus，RV)最常见而且是唯一与发作显著相关的病原体。RV为单链RNA(single－stranded RNA，ssRNA)，在复制过程中生成双链RNA(double－stranded RNA，dsRNA)，dsRNA的模拟合成物聚肌胞苷酸［polyinocinic－polycytidylic acid，poly(I:C)］模拟病毒感染通常用于研究病毒对多种细胞的影响。研究发现poly(I:C)破坏气道上皮屏障，增加上皮细胞、成纤维细胞和气道平滑肌细胞外基质(extracellular matrix，ECM)沉积［3－4］并诱导成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞。体内模型证实poly(I:C)增强抗原致敏，增加气道炎性细胞浸润并增强气道高反应性，表明RV在哮喘气道重塑中发挥重要作用。然而，poly(I:C)在成纤维细胞活化过程中的作用机制目前仍不清楚。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)破坏ECM和细胞连接，促进炎性细胞募集，成纤维细胞衍生的MMPs可调节纤维化反应，促进成纤维细胞收缩。RV感染人支气管上皮细胞增加MMP－9表达［5］，加重气道损伤和重塑过程。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)诱导邻近细胞生成MMPs［6］，调节正常组织重构和分化过程中MMPs表达以及存在肌成纤维细胞的非肿瘤状态，提示EMMPRIN可能参与肌成纤维细胞分化。EMMPRIN可触发细胞骨架重组形成收缩性应力纤维影响收缩表型。我们推测，RV感染可能导致EMMPRIN上调，诱导成纤维细胞活化，促进气道炎症和重塑。本研究调查poly(I:C)刺激的上皮细胞对成纤维细胞增殖和α－SMA表达的影响，确定EMMPRIN在该过程的作用及信号通路。

材料和方法

1 材料

人肺泡上皮细胞株(A549)由中国科技大学中心实验室提供;胎牛血清(FCS，杭州四季青公司)、MEM(Hyclone)、EMMPRIN(R＆D)、poly(I:C)(Sigma);p38 MAPK选择性阻断剂SB203580和ERK1/2选择性阻断剂PD98059(Sigma)，磷酸化与非磷酸化p38 MAPK和ERK1/2抗体(Promega)，小鼠抗人α－SMA单克隆抗体(Novocastra)，EMMPRIN ELISA试剂盒(R＆D)。

2 方法

2.1 气道上皮细胞条件培养基(conditioned medium，CM)制备 A549细胞经胰酶消化后以每孔2×106接种于6孔培养板，用含10%FCS的MEM培养至90%汇合，以含20 mg/L poly(I:C)的无血清MEM培养，24 h后收集CM，2 000 r/min离心5 min，过滤后用于下述实验。

2.2 人气道成纤维细胞原代培养 按作者既往方法［7］进行贴块培养，标本源自弋矶山医院肺癌病人。

2.3 A549－CM刺激成纤维细胞 将成纤维细胞接种于24孔板盖玻片上(免疫组化)或6孔板(提取细胞蛋白)各孔中，待达到80% ～90%汇合时换无血清MEM培养24 h。实验分3组:MEM－成纤维细胞、正常A549－CM(以MEM 1∶1稀释)－成纤维细胞和poly(I:C)－A549－CM(1∶1稀释，下同)－成纤维细胞;在另一些孔中预先1 h加入SB203580(5或10 μmol/L)或 PD98059(5 或10 μmol/L)后以 poly(I:C)－A549－CM培养。培养12 h、24 h或48 h检测细胞增殖或α－SMA表达，部分培养0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h提蛋白检测磷酸化与非磷酸化 p38 MAPK和ERK1/2水平，选择12 h、24 h及48 h的成纤维细胞上清－80℃冻存待测EMMPRIN，48 h上清用于MMP－2、－9酶谱分析。

2.4 EMMPRIN刺激成纤维细胞 用与2.3相似的方法培养成纤维细胞，分别给予MEM和EMMPRIN(5 mg/L或10 mg/L)刺激12 h或48 h，检测细胞增殖和α－SMA表达，48 h取上清进行 MMP－2和MMP－9酶谱分析。

2.5 细胞增殖实验 以BrdU细胞掺入测定成纤维细胞增殖，将成纤维细胞以每孔5×104接种于24孔板中盖玻片，至80%汇合时无血清MEM培养24 h;分别以MEM或正常A549－CM或poly(I:C)－A549－CM培养成纤维细胞，每种培养均设立3复孔平行实验。培养16 h后加入BrdU(100 mmol/L)，继续培养8 h后固定细胞进行BrdU免疫组化实验。

2.6 α－SMA免疫荧光与 Western blotting检测4%多聚甲醛固定细胞30 min(室温)，0.05%Triton X－100穿透细胞10 min，α－SMA抗体1∶50。依次加FITC－标记的羊抗鼠Ⅱ抗、Alex 594 phalloidin(1∶1 000)和 DAPI(500 μg/L，95% 乙醇稀释)后，80%甘油封片。荧光显微镜下观察α－SMA(绿色)，截图保存。Western blotting检测:PBS漂洗细胞2次，加100 μL 1×SDS裂解液，刮下细胞至EP管，冰上孵育10 min，95℃煮沸3～5 min，14 000 r/min离心10 min，BSA法测浓度。取50 μg蛋白 SDSPAGE电泳，转印至硝酸纤维素膜上，脱脂奶室温封闭1 h，Ⅰ抗4℃孵育过夜，Ⅱ抗室温1 h，ECL发光显色。ImageJ软件进行图像处理，测定灰度值。

2.7 p38 MAPK和ERK1/2的Western blotting检测采用与2.6相似的方法。利用ImageJ软件进行分析，以非磷酸化条带为内参照，计算磷酸化与相应非磷酸化条带灰度的相对比值。

2.8 成纤维细胞凝胶收缩实验 参照文献制备成

纤维细胞－胶原混悬液(0.75 g/L胶原，1×108/L成纤维细胞，1×MEM，pH 7.4)，并立即将该混悬液移入24孔培养板中(每孔加600 μL)，37℃培养箱内20～30 min，待混悬液形成凝胶时每孔加入400 μL含10%FCS的MEM继续培养，次日无血清MEM培养24 h，用加样枪枪头尖端沿凝胶边缘轻轻分离凝胶。实验分3组:MEM－成纤维细胞、正常A549－CM－成纤维细胞和poly(I:C)－A549－CM－成纤维细胞，每组3孔，培养48 h后取出凝胶并拍照。以凝胶直径缩小的程度表示凝胶收缩能力的强弱。同样实验进行3次，比较各组凝胶直径与无细胞情况下凝胶直径的差异，计算收缩的百分比。

2.9 MMP－2和MMP－9酶谱分析 收集成纤维细胞上清，冷冻离心去除细胞碎片。取5 μL样本进行含0.1%明胶的 SDS－PAGE非变性凝胶电泳，2.5%Triton X－100室温轻摇漂洗30 min去除SDS，37℃孵育过夜，考马斯蓝染色后脱色。对脱色后条带拍照并用ImageJ软件进行分析，以正常成纤维细胞上清MMP－2和MMP－9为内参照，计算A549－CM－成纤维细胞和poly(I:C)－A549－CM－成纤维细胞上清MMP－2和MMP－9条带灰度的相对比值。

3.0 EMMPRIN浓度测定 采用ELISA法检测成纤维细胞上清 EMMPRIN水平，操作按说明进行。EMMPRIN最低测定限值为1.35 ng/L。

3 统计学处理

数据以均数±标准差(¯x±s)表示，采用SPSS 11.0软件进行统计学分析;多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 poly(I:C)－上皮细胞上清诱导成纤维细胞增殖

由图1可见，poly(I:C)－上皮细胞上清诱导成纤维细胞增殖，12 h最明显，其后刺激作用渐减弱;正常上皮细胞上清也刺激成纤维细胞增殖，但无poly(I:C)－上皮细胞上清作用明显。BrdU掺入率的结果显示:poly(I:C)－上皮细胞上清刺激的成纤维细胞12 h增殖率显著高于MEM或正常上皮细胞上清刺激的成纤维细胞(P＜0.01)，而24 h和48 h增殖率虽明显高于MEM培养的成纤维细胞(P＜0.05)，但与正常上皮细胞上清刺激的成纤维细胞无显著差异;相对于MEM，正常上皮细胞上清也明显刺激成纤维细胞增殖，24 h最显著(P ＜0.01)，见表1。

Figure 1.Effect of A549 cell supernatants on the proliferation of human bronchial fibroblasts(HBFs).HBFs growing in 24－well plates were cultured under FCS－free condition with MEM(1)，normal A549－CM(2)or poly(I:C)－A549－CM(3)for 12，24 or 48 h.Cell proliferation was assessed with the BrdU DNA －incorporation assay.图1 A549细胞上清对人气道成纤维细胞增殖的影响

2 Poly(I:C)－上皮细胞上清诱导成纤维细胞α－SMA表达和凝胶收缩

表1 A549细胞上清对气道成纤维细胞增殖率的影响Table 1.Effect of A549 cell supernatants on airway fibroblast proliferation rate(%.¯x±s.n=3)

免疫荧光、Western blotting及凝胶收缩实验显示，poly(I:C)－上皮细胞上清增加成纤维细胞α－SMA表达和凝胶收缩，48 h最显著;正常上皮细胞上清轻度刺激成纤维细胞α－SMA表达和凝胶收缩，但不及poly(I:C)－上皮细胞上清刺激作用明显，见图2。

Figure 2.Effects of A549 cell supernatants on α － SMA expression(A:immunofluorescence;B:Western blotting)in HBFs and contraction of HBF－populated collagen gels(C).HBFs were cultured with MEM(1)，normal A549－CM(2)or poly(I:C)－A549－CM(3)for 12，24 or 48 h.¯x±s.n=3.*P＜0.05 vs 1;#P＜0.05 vs 2.图2 A549细胞上清对人气道成纤维细胞α－SMA表达和凝胶收缩的影响

3 Poly(I:C)－上皮细胞上清诱导成纤维细胞EMMPRIN表达

见图3A;同时α－SMA表达增加，并且EMMPRIN浓度越高刺激作用更明显，见图3B。

Poly(I:C)－上皮细胞上清刺激成纤维细胞后，其培养上清中EMMPRIN含量明显高于另2组相应时点(P＜0.05)，正常上皮细胞上清刺激的成纤维细胞上清中EMMPRIN含量较MEM组虽增加，但差异均不显著(P＞0.05)，见表2。

4 EMMPRIN诱导成纤维细胞增殖和α－SMA表达

表2 A549细胞上清对成纤维细胞EMMPRIN表达的影响Table 2.Effects of A549 cells supernatants on airway fibroblasts EMMPRIN expression(ng/L.¯x±s.n=3)

成纤维细胞给予EMMPRIN刺激后，增殖增强，

Figure 3.Effects of EMMPRIN on proliferation(A)of HBFs and α － SMA expression(B)in HBFs.HBFs growing in 24 － well plates were cultured under FCS－free condition with MEM(1)，5 mg/L EMMPRIN(2)or 10 mg/L EMMPRIN(3)for 12 h(A)or 48 h(B).¯x±s.n=3.*P＜0.05 vs 1 or 2.图3 EMMPRIN对人气道成纤维细胞增殖和α－SMA表达的影响

5 EMMPRIN为poly(I:C)－上皮细胞上清诱导成纤维细胞MMP－2和MMP－9生成的重要成分

酶谱分析MMP－2和MMP－9活性显示:相对于MEM或正常A549－CM刺激的成纤维细胞上清，MMP－2和MMP－9活性在poly(I:C)－A549－CM刺激的成纤维细胞上清中升高，见图4;以EMMPRIN刺激成纤维细胞，其上清中MMP－2和MMP－9活性相应升高，并且浓度越高刺激作用越明显，见图5。

6 Poly(I:C)－上皮细胞上清诱导成纤维细胞p38 MAPK和ERK1/2信号通路活化，后两者参与α－SMA和EMMPRIN表达

Western blotting结果表明，poly(I:C)－上皮细胞上清刺激成纤维细胞1 h后，p－p38 MAPK蛋白出现，2～4 h最明显，其后减弱;p－ERK1/2蛋白在刺激1 h后达高峰，持续至4 h后减弱，见图6A。p38 MAPK或ERK1/2抑制剂抑制相应蛋白表达，同时减弱α－SMA表达，见图6B。p38 MAPK和ERK1/2抑制剂均明显减弱poly(I:C)－A549－CM诱导的成纤维细胞EMMPRIN表达，SB203580呈浓度依赖性，而5 μmol/L 和 10 μmol/L PD98059 的抑制作用无显著差异，见表3。

讨 论

成纤维细胞分化为肌成纤维细胞是哮喘气道重塑的一个重要方面，我们过去实验发现损伤的气道上皮细胞诱导成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞［7］，在本实验中，我们以RV dsRNA模拟合成物poly(I:C)作用的上皮细胞上清刺激成纤维细胞，间接了解RV感染气道上皮细胞后对成纤维细胞活化的影响，结果发现poly(I:C)作用的上皮细胞上清时间依赖性诱导成纤维细胞增殖并增强α－SMA表达，提示RV感染支气管上皮细胞后诱导成纤维细胞增殖促进气道壁纤维化，而收缩蛋白的表达增强气道反应性。

Figure 4.Effects of poly(I:C)－A549 cell supernatants on MMP－2 and MMP－9 activity in HBFs.HBFs growing in 24－well plates were cultured under FCS－free condition with MEM(1)，normal A549－CM(2)or poly(I:C)－A549－CM(3)for 48 h.MMP－2 and MMP－9 activity in supernatants from HBFs was assessed with zymography.¯x±s.n=3.*P＜0.05 vs 1 or 2.图4 Poly(I:C)－A549细胞上清对成纤维细胞MMP－2和MMP－9活性的影响

Figure 5.Effects of EMMPRIN on MMP－2 and MMP－9 activity in HBFs.HBFs growing in 24－well plates were cultured under FCS－free condition with MEM(1)，5 mg/L EMMPRIN(2)or 10 mg/L EMMPRIN(3)for 48 h.MMP－2 and MMP－9 activity in supernatants from HBFs was assessed with zymography.¯x±s.n=3.*P ＜0.05 vs 1.图5EMMPRIN对成纤维细胞MMP－2和MMP－9活性的影响

EMMPRIN是一个58 kD跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白(Ig)超家族，EMMPRIN可从细胞表面脱落，作为一种弥散因子作用于邻近细胞，或作为转化生长因子(transforming growth factor，TGF)β下游介质诱导成纤维细胞分化。已报道［8］EMMPRIN可诱导α－SMA表达参与肌成纤维细胞分化和胶原基质收缩。本研究观察到poly(I:C)作用的上皮细胞上清增强成纤维细胞上清中EMMPRIN水平，后者剂量依赖性进一步诱导成纤维细胞增殖和α－SMA表达，提示EMMPRIN是RV感染诱导气道重塑过程中成纤维细胞活化的一种重要中间媒介。

EMMPRIN的直接功能是诱导多种MMPs生成，人重组EMMPRIN刺激成纤维细胞MMP－1、MMP－2和MMP－3生成和激活，呼吸机相关性肺损伤大鼠肺组织MMP－2增多前EMMPRIN mRNA表达增加，这些MMPs在ECM降解及组织中性粒细胞浸润发挥关键作用，还与组织重塑有密切关系。有关研究认为支气管成纤维细胞MMP－2活性与哮喘病人FEV1%预测值负相关，而与气道高反应性呈正相关;MMP－9与气道炎症和重塑的相关性体现在MMP－9缺陷的小鼠哮喘模型支气管壁纤维化减轻并且肺总胶原蛋白减少，MMP－9抑制剂延缓过敏性气道炎症的发展。此外，研究也表明MMPs可促进成纤维细胞收缩反应，表达α－SMA的肌成纤维细胞同时表达高水平的MMPs如MMP－2［8］。鉴于过敏性哮喘患者支气管肺泡灌洗液、血、痰MMP－2和MMP－9水平显著升高，同时人鼻病毒－16感染增加支气管上皮细胞MMP－9表达，我们检测了poly(I:C)－上皮细胞上清对成纤维细胞MMP－2、－9生成的诱导作用，poly(I:C)作用的上皮细胞上清增强成纤维细胞上清中MMP－2、MMP－9活性，并且EMMPRIN浓度依赖性激活成纤维细胞MMP－2、MMP－9活性，这提示EMMPRIN诱导成纤维细胞MMP－2、－9激活在RV触发气道重塑过程中具有重要作用。

Figure 6.Effects of poly(I:C)－A549 cell supernatants on p38 MAPK and ERK 1/2 phosphorylation and roles of p38 MAPK and ERK1/2 signaling pathways in α － SMA expression in HBFs.A:HBFs were incubat for the indicated time with poly(I:C)－A549－CM，after which cell lysates were prepared and subject to immunoblotting analysis with antibodies to p38 MAPK，ERK1/2，or their phosphorylated forms.B:HBFs pre － added with SB203580 or PD98059 for 1 h were cultured with poly(I:C)－A549 －CM for 1 h(for p38 MAPK and ERK1/2)or 48 h(for α －SMA).p38 MAPK，ERK1/2 and α －SMA expression were measured by Western blotting.1:poly(I:C)－A549－CM;2:poly(I:C)－A549－CM+5 μmol/L SB203580;3:poly(I:C)－A549－CM+10 μmol/L SB203580;4:poly(I:C)－A549－CM;5:poly(I:C)－A549－CM+5 μmol/L PD98059;6:poly(I:C)－A549－CM+10 μmol/L PD98059.¯x±s.n=3.*P＜0.05 vs 0 h;#P＜0.05 vs 3 or 6;☆P＜0.05 vs 2 or 5.图6 A549细胞上清对人气道成纤维细胞p38 MAPK和ERK1/2信号活化的影响及p38 MAPK和ERK1/2在α－SMA表达的作用

表3 Poly(I:C)－A549上清对成纤维细胞24 h EMMPRIN表达的影响及SB203580、PD98059的作用Table 3.Effects of poly(I:C)－A549 cell supernatants on EMMPRIN in HBFs at 24 h and the roles of SB203580 and PD98059(ng/L.¯x±s.n=3)

研究表明丝裂原活化蛋白激酶家族的2种关键信号:p38 MAPK调控许多细胞过程包括应激反应、细胞分化、增殖、炎症、血管发生和细胞因子生成，还调节平滑肌细胞和上皮细胞α－SMA表达，增强氧化应激诱导的气道收缩反应［9］;ERK1/2参与成纤维细胞增殖和胶原合成，亦能诱导细胞α－SMA表达，体外实验表明，RV诱导的人支气管上皮细胞ERK 1/2信号激活是MMP－9表达上调的关键信号［10］。p38 MAPK和ERK1/2也是人肺成纤维细胞α－SMA表达的关键信号分子［9］，我们曾发现p38 MAPK与ERK1/2是损伤气道上皮细胞诱导上皮下成纤维细胞向肌纤维母细胞转分化的重要信号［7］。Poly(I:C)可激活成纤维细胞p38 MAPK和 ERK1/2信号通路［11］，介导poly(I:C)诱导的成纤维细胞炎症因子、趋化因子和黏附分子合成。既往研究发现EMMPRIN表达上调过程中p38 MAPK和ERK1/2激活［12］，提示 p38 MAPK和 ERK1/2通路参与 EMMPRIN的表达。本研究中我们观察到poly(I:C)作用的上皮细胞上清时间依赖性诱导成纤维细胞p38 MAPK和ERK1/2磷酸化，刺激60 min后两者磷酸化水平均增加并持续激活，两者特异性抑制剂有效减弱α－SMA表达;此外，p38 MAPK和ERK1/2抑制剂减弱poly(I:C)作用的上皮细胞上清诱导的成纤维细胞EMMPRIN表达，说明这2种信号参与了poly(I:C)作用的上皮细胞诱导成纤维细胞EMMPRIN表达过程。

总之，本研究表明，poly(I:C)作用的上皮细胞可能通过某些介质如 EMMPRIN－MMPs，经由 p38 MAPK和ERK1/2信号通路诱导成纤维细胞增殖或肌成纤维细胞分化，进一步表明RV感染在哮喘急性发作期气道反应性升高发生机制中的重要地位，阻断p38 MAPK和ERK1/2通路调节EMMPRIN表达可能对病毒感染诱发的气道重塑具有有益的治疗价值。

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