梁柳琴， 陈伟玲， 邱 茜， 詹钟平， 叶玉津， 杨岫岩， 许韩师

(中山大学附属第一医院风湿内科，广东广州510080)

T细胞在系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)的发病机制中起着关键性作用。“病理性活化”的T细胞不仅启动B细胞多克隆活化和扩增，导致高球蛋白血症和自身抗体过度产生，而且还广泛浸润到多种组织和脏器，如肾脏、皮肤、中枢神经系统和关节等，从而导致组织的慢性炎症损伤和功能失调［1－2］。T细胞由外周血进入脏器组织是一个复杂的多步骤过程，包括循环中游离的T细胞黏附到血管内皮和穿过内皮向组织迁徙。如果能够控制T细胞的迁徙过程，则有可能减轻狼疮的脏器损害。Rho激酶(Rho kinase，ROCK)是小分子GTP酶RhoA信号下游的一个关键性蛋白，广泛参与细胞的生物学过程，特别对细胞骨架形成、黏附、迁移等细胞活动具有关键的调控作用［3－4］。但ROCK是否参与SLE的发病机制目前仍不清楚。为此，本文将研究SLE患者T细胞ROCK活性情况，并探讨其对SLE患者T细胞黏附和迁移是否有调控作用，以期为SLE的治疗寻找新思路。

材料和方法

1 研究对象

33例SLE来自于2005年6月至2010年10月中山大学附属第一医院风湿免疫科住院和门诊患者，均符合美国风湿病学会1982年诊断标准，其中女性27例，男性6例，所有患者均未用过或停用3个月以上激素和免疫抑制剂，SLE疾病活动指数为5～18分。另设健康成年人12例作为健康对照组(healthy control，HC)，同时还有9例活动性类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)患者作为对照。

2 外周血T细胞的分离和培养

抽取患者和对照组外周静脉血，采用RosettSep T细胞提取试剂盒(StemCell Technologies)分离T细胞，按厂家提供的实验步骤操作。用抗CD3单抗(BD PharMingen)在流式细胞仪上检测T细胞纯度，发现T细胞纯度均在95%以上。把分离得到的T细胞用RPMI－1640培养基和10%FBS(均购自Gibco)培养待用。用台盼蓝拒染法检测细胞活性，细胞活性均超过95%。

3 提取细胞总蛋白

用冷1×PBS洗涤T细胞1次，加入50 μL SDS样本裂解缓冲液 A(50 mmol/L Tris － HCl，pH 7.5，10 mmol/L MgCl2，500 mmol/L NaCl，1%Triton X －100，0.5%去氧胆酸钠，0.1%SDS，1 mmol/L PMSF，10 mg/L亮抑肽酶，10 mg/L抑肽酶)，匀浆后置冰上，超声粉碎10～15 s，于95～100℃煮5 min，然后置冰上;4℃ 12 000 r/min离心5 min，吸取上清，分装储存于－20℃。

4 ROCK活性检测

因为肌球蛋白磷酸酶靶亚基1(myosine phosphatase target subunit 1，MYPT1)是ROCK的主要底物之一，其磷酸化被认为是ROCK活化的重要标志，所以ROCK活性用磷酸化MYPT1蛋白表达来表示。本文采用免疫印迹法检测磷酸化MYPT1蛋白表达。

5 免疫印迹法

把样品蛋白于95～100℃煮5 min，然后等量上样于15%SDS－PAGE凝胶上进行电泳，开始电压为90 V，溴酚蓝进入分离胶层时调至120 V，待溴酚蓝接近至凝胶底部时停止电泳(电泳缓冲液为1×Tris－甘氨酸缓冲液，pH 7.9)，用转移缓冲液把凝胶上蛋白质转移至醋酸纤维膜上，膜在室温下用5%脱脂奶粉封闭液封闭1 h，然后膜与不同浓度Ⅰ抗(磷酸化 MYPT1为1∶500，β －肌动蛋白为1∶2 000，均购自Santa Cruz)于4℃孵育过夜，接着膜在室温下与Ⅱ抗(辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG，1∶2 000，购自Santa Cruz)孵育1 h，TBST洗膜后用ECL液显影，最后将结果进行图像分析，计算吸光度(A)值，ROCK活性以磷酸化MYPT1 A值与β－肌动蛋白A值之比表示。

6 T细胞黏附能力测定

T细胞(5×105)悬浮于300 μL无血清培养基，然后种植于包被有2 g/L透明质酸(hyaluronic acid，HA，购自Sigma－Aldrich)的24孔培养板，置37℃孵育15、30和60 min。根据实验要求，部分组别细胞用Y27632(20 μmol/L，购自Chemicon)预处理30 min。孵育后，培养板用PBS冲洗3次，然后在显微镜(×100)下计数黏附细胞。所有样本均设复孔。

7 T细胞迁移能力测定

T细胞的趋化性迁移实验采用Transwell小室(直径6.5 mm，孔径5 μm，购自Costar)。T 细胞(5 ×105)悬浮于100 μL无血清培养基，种植于包被有2 g/L HA的Transwell小室滤网，置37℃孵育包被有2 g/L HA(购自Sigma－Aldrich)的24孔培养板，置37℃孵育30 min。把含有80 μg/L CXCL12(购自R＆D systems)的无血清培养基加至Transwell的下室，然后再于37℃孵育2 h。根据实验要求，部分组别细胞用Y27632(20 μmol/L)预处理30 min。最后对迁移至下室的细胞进行计数。所有样本均设复孔。

8 统计学处理

数据以均数±标准差(¯x±s)表示，组间均数比较用t检验或单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 SLE患者外周血T细胞ROCK活性的检测

新鲜分离、未行体外培养的SLE患者T细胞ROCK活性显著高于正常对照组和类风湿关节炎患者，提示SLE患者体内外周血T细胞中ROCK活性异常增高，见图1。

Figure 1.Measurement of ROCK activity in T cells from healthy control(HC)，rheumatoid arthritis(RA)and systemic lupus erythematosus(SLE)patients.T cells were isolated by RosettSep T cell purification kit.ROCK activity was assessed by evaluating p－MYPT1 with Western blotting analysis.¯x±s.*P＜0.05 vs HC or RA.图1 SLE患者外周血T细胞ROCK活性的检测

2 SLE患者外周血T细胞体外黏附能力的检测

如图2所示，新鲜分离的SLE患者外周血T细胞体外黏附于HA包被膜的能力显著高于RA患者和正常对照组。

Figure 2.Detection of in vitro adhesion of T cells from healthy control(HC)，rheumatoid arthritis(RA)and systemic lupus erythematosus(SLE)patients.¯x±s.*P＜0.05 vs HC or RA.图2 SLE患者外周血T细胞体外黏附能力的检测

3 SLE患者外周血T细胞体外迁移能力的检测

如图3所示，在趋化因子CXCL12(80 μg/L)的诱导下，SLE患者外周血T细胞体外迁移的能力亦显著高于RA患者和正常对照组。

Figure 3.Detection of migration of T cells from healthy control(HC)，rheumatoid arthritis(RA)and systemic lupus erythematosus(SLE)patients.Purified T cells were plated on the top chamber of a Transwell apparatus and incubated with serum－free RPMI－1640 medium for 30 min.Then RPMI－1640 supplemented with 80 μg/L CXCL12 was added into the lower chamber and incubated for 2 h at 37℃.¯x±s.*P＜0.05 vs HC or RA.图3 SLE患者外周血T细胞体外迁移能力的检测

4 SLE患者T细胞黏附和迁移能力与SLE疾病活动指数(SLE disease activity index，SLEDAI)的相关性分析

如表1所示，SLE重度(SLEDAI＞15)活动组T细胞黏附和迁移能力均高于轻度(SLEDAI≤9)和中度(SLEDAI 10～15)活动组，但轻度和中度活动之间则无显著差异。

表1 不同疾病活动度SLE患者T细胞黏附和迁移能力的比较Table 1.Comparison of adhesion and migration of T cell from SLE patients with different disease activity(¯x±s)

5 ROCK抑制剂对SLE患者T细胞黏附能力的影响

用ROCK特异性抑制剂Y27632(20 μmol/L)预处理SLE患者T细胞30 min，然后检测其黏附能力，结果发现，Y27632对SLE患者T细胞的体外黏附能力有显著抑制作用，见图4。

Figure 4.Inhibitory effect of Y27632 on adhesion of T cells from SLE patients.¯x±s.n=9.*P＜0.05 vs non－treatment.图4 ROCK抑制剂Y27632对SLE患者T细胞黏附的影响

6 ROCK抑制剂对SLE患者T细胞迁移的影响

用ROCK特异性抑制剂Y27632(20 μmol/L)预处理SLE患者T细胞30 min，然后在CXCL12诱导下进行迁移实验，结果发现，Y27632显著抑制SLE患者T细胞迁移，见图5。

Figure 5.Inhibitory effect of Y27632 on migration of T cells from SLE patients.T cells were treated with 20 μmol/L Y27632 for 30 min.Chemotactic migration of T cells was measured as described in the legend of figure 3.¯x±s.n=9.*P＜0.05 vs non－treatment.图5 ROCK抑制剂Y27632对SLE患者T细胞迁移的影响

讨 论

SLE是一种可出现多脏器损害的慢性炎症性疾病，在受损的组织和脏器中出现大量的炎症细胞浸润，其中T细胞是主要的浸润细胞。浸润的T细胞直接或间接地参与局部的炎症反应，最终导致SLE的脏器功能障碍。局部浸润的T细胞主要来源于外周循环系统，外周血中的T细胞迁徙至局部组织要经过一个复杂的过程，除了与血管内皮功能改变有关外，T细胞本身功能如黏附、迁移能力改变也起着关键作用。已有报道SLE患者T细胞黏附能力较正常人明显升高［5－6］。本研究发现，SLE患者外周血T细胞体外黏附和迁移能力显著高于RA患者和正常对照组，提示SLE出现脏器炎症损害与其T细胞的黏附和迁移能力异常有关，如能抑制T细胞的异常黏附和迁移可能有利于控制狼疮的脏器损害。

Rho家族蛋白是小分子GTP酶，具有广泛的生物学功能，特别在调节细胞迁移、黏附、信号转导等方面具有重要作用。作为RhoA下游的关键信号蛋白，ROCK在转导Rho通路活化信息方面起到举足轻重的作用［7］。

近年研究发现，ROCK在介导外周血白细胞的黏附和迁徙方面起着重要作用。单核细胞中RhoA的过度活化可使其黏附和跨内皮迁移能力明显增强，而Y27632能显著抑制这种能力［8］。相似地，Y27632也抑制单核细胞趋化因子－1(MCP－1)诱导的白细胞迁移［9］。利用转基因小鼠研究发现，敲除ROCK1基因小鼠的白细胞黏附和迁移能力显著下降，血管壁中浸润的白细胞明显减少［10］。上述研究提示，抑制ROCK活化可能对调控外周血白细胞参与的局部组织炎症具有重要作用。

在本研究中，我们发现SLE患者新鲜分离的外周血T细胞ROCK活性显著高于类风湿关节炎患者和正常对照组，提示ROCK可能参与SLE的发病机制。进一步研究发现，ROCK特异性抑制剂Y27632对SLE患者T细胞的体外黏附和迁移均有显著抑制作用，提示SLE患者T细胞中异常活化的ROCK可能是其T细胞发生异常黏附和迁移的关键调控因素之一。如上所述，T细胞在SLE的发病和脏器损害中具有举足轻重的作用，外周血中T细胞黏附和迁徙能力的强弱对T细胞能否迁徙到脏器并在局部大量浸润从而引起炎症反应起到关键作用，通过调控T细胞迁移的关节靶点有利于抑制局部脏器的炎症损害，因此，本文的研究结果有可能为防治SLE提供新的思路。

总之，本研究发现SLE患者外周血T细胞中ROCK处于异常活化状态，通过抑制ROCK活化能抑制T细胞的黏附和迁移，ROCK通路很可能是调节SLE T细胞局部脏器浸润的新靶点，抑制该通路活性可能有利于SLE的治疗。但ROCK调控SLE T细胞黏附和迁移的分子机制有待进一步研究。

［1］ Horowitz DA，Stohl W，Gray JD.T lymphocytes，natural killer cells and immune regulation［M］//Wallance DJ，Hahn BH.Dubois’ lupus erythematosus.6th edition.Philadelphia:Lippincott，Williams ＆ Wilkins，2002:157－185.

［2］ 梁柳琴，许韩师，叶玉津，等.白介素－15在狼疮性肾炎活动病变中的临床意义［J］.中国病理生理杂志，2008，24(8):1581－1584.

［3］ Burridge K，Wennerberg K.Rho and Rac take center stage［J］.Cell，2004，116(2):167 －179.

［4］ Street CA，Bryan BA.Rho kinase proteins:pleiotropic modulators of cell survival and apoptosis［J］.Anticancer Res，2011，31(11):3645 －3657.

［5］ Estess P，DeGrendele HC，Pascual V，et al.Functional activation of lymphocyte CD44 in peripheral blood is a marker of autoimmune disease activity［J］.J Clin Invest，1998，102(6):1173－1182.

［6］ Li Y，Harada T，Juang YT，et al.Phosphorylated ERM is responsible for increased T cell polarization，adhesion and migration in patients with systemic lupus erythematosus［J］.J Immunol，2007，178(3):1938 －1947.

［7］ Delprato A.Topological and functional properties of the small GTPases protein interaction network［J］.PLoS One，2012，7(9):e44882.

［8］ Honing H，van den Berg TK，van der Pol SM，et al.RhoA activation promotes transendothelial migration of monocytes via ROCK［J］.J Leukoc Biol，2004，75(3):523－528.

［9］ Worthylake RA，Burridge K.RhoA and ROCK promotes migration by limiting membrane protrusions［J］.J Biol Chem，2003，278(15):13578－13584.

［10］ Noma K，Rikitake Y，Oyama N，et al.ROCK1 mediates leukocyte recruitment and neointima formation following vascular injury［J］.J Clin Invest，2008，118(5):1632－1644.