刘 丹， 孙 惦， 许 旻， 周 敏， 吴晓牧， 何 明△

(1南昌大学医学院，2江西省人民医院神经内科，江西南昌330006)

一直以来，人们对心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤机制的研究都聚焦于Ca2+，而Cl－作为机体内最富生理意义的阴离子，其在心肌缺血/再灌注损伤中的作用却一直未得到重视。本实验室一直致力于研究Cl－在心肌缺氧/复氧(anoxia/reoxygenation，A/R)损伤中所起的作用，已发现去除细胞外Cl－能通过减少氧化应激而很好地对抗心肌A/R损伤，但具体机制不明。AMP活化的蛋白激酶(AMP－activated protein kinase，AMPK)是高度保守的蛋白激酶家族，由于其在调节能量代谢、参与氧化应激等方面的突出作用而日趋引起人们的关注［1］。AMPK是一个由催化亚基α(63 kD)、调节亚基β(30 kD)和 γ(38～63 kD)所构成的异源三聚体［2］。α 亚基含有一个重要的Thr172残基，是主要的活性基团，磷酸化使AMPK激活［3］。那么AMPK是否与这种由活性氧(reactive oxygen species，ROS)介导的氯离子动态变化所致心肌急性A/R损伤有关呢?目前还未有文献报道。为此，本实验拟用RNA干扰技术，构建pSuper－AMPKα2 shRNA重组质粒，转染H9c2细胞，并建立A/R损伤模型以模拟I/R损伤，以期探讨AMPK在Cl－介导的心肌A/R损伤中所起的作用，为研究心肌I/R损伤机制拓展思想、提供理论和实验依据。

材料和方法

1 细胞与主要试剂

大鼠H9c2心肌样细胞:中国科学院细胞库;pSuper.Retro质粒:美国波士顿大学罗志军教授惠赠;限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ:NEB;T4 DNA连接酶、凝胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自Promega;AMPKα2抗体、β－actin抗体及相应II抗购自Santa Cruz;LipofectamineTM2000购自Invitrogen;MEM培养基购自Gibco－BRL;ROS检测试剂盒购自Beyotime Institute of Biotechnology;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;增强化学发光印迹试剂、硝酸纤维素膜(Amersham)、胰酶、MTT、HEPES、PMSF、亮肽素、丙烯酰胺、SDS、亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、EDTA和DTT购自Sigma;其它试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 质粒构建 在 GenBank中搜索出大鼠AMPKα2 mRNA全长序列(NM_023991)，登陆Ambion公司网站在线设计3条siRNA靶序列，分别为:(1)5’－GCGAGCAACUAUCAAAGAC－3’(764);(2)5’－CCCAAAGCACGCUGUCCAC－3’(1131);(3)5’－ACUCUACCAAGUGAUCAGC －3’(233)。以质粒 pSuper.Retro为载体，限制性内切酶 BamHⅠ、XhoⅠ双切后，插入带有黏性末端的 AMPKα2 shRNA核苷酸序列。按小提质粒试剂盒说明操作提取质粒，转化菌液送北京天根生化科技有限公司测序鉴定。

2.2 重组质粒转染 转染前，PBS洗涤细胞2次，尽量去除抗生素和血清，将 LipofectamineTM2000(μL)与 DNA(μL)以 2.0∶0.8 的比例混合，加入到每孔细胞中去，置于培养箱(5%CO2、95%空气，37℃)中孵育5 h后，换含血清的培养基。以空载质粒载体pSuper为对照。

2.3 重组质粒干扰效率的检测 为了更好地提高干扰效率，将3个含AMPKα2基因序列特异性shRNA 的重组质粒(pSuper－AMPKα2 shRNA1，pSuper－AMPKα2 shRNA2，pSuper－ AMPKα2 shRNA3)同时转染到心肌细胞 H9c2中，Western blotting检测AMPKα2的蛋白表达水平。

2.4 缺氧液、复氧液及去除细胞外Cl－(Cl－－free)液的配制 缺氧液:0.9 mmol·L－1NaH2PO4，6.0 mmol·L－1NaHCO3，1.2 mmol·L－1MgSO4，1.8 mmol·L－1CaCl2，98.5 mmol·L－1NaCl，10.0 mmol·L－1KCl，40 mmol·L－1乳酸钠，20 mmol·L－1HEPES，pH 6.8;复氧液:0.9 mmol·L－1NaH2PO4，20.0 mmol·L－1NaHCO3，1.2 mmol·L－1MgSO4，1.8 mmol·L－1CaCl2，129.5 mmol·L－1NaCl，5.0 mmol·L－1KCl，55 mmol·L－1葡萄糖，20 mmol·L－1HEPES，pH 7.4;Cl－－free缺氧液:0.9 mmol·L－1NaH2PO4，6.0 mmol·L－1NaHCO3，1.2 mmol·L－1MgSO4，1.8 mmol·L－1葡萄糖酸钙，98.5 mmol·L－1葡萄糖酸钠，10.0 mmol·L－1葡萄糖酸钾，40 mmol·L－1乳酸钠，20 mmol·L－1HEPES，pH 6.8;Cl－－free 复氧液:0.9 mmol·L－1NaH2PO4，20.0 mmol· L－1NaHCO3，1.2 mmol· L－1MgSO4，1.8 mmol·L－1葡萄糖酸钙，129.5 mmol·L－1葡萄糖酸钠，5.0 mmol·L－1葡萄糖酸钾，55 mmol·L－1葡萄糖，20 mmol·L－1HEPES，pH 7.4。

2.5 实验分组 (1)正常对照(control)组:去除原培养基，换用复氧液置于培养箱(5%CO2、95%空气，37℃)3 h，再换上复氧液孵育2 h;(2)A/R组:去除原培养液，换用模拟缺氧缺糖溶液将培养板置于持续95%N2、5%CO2平衡的缺氧密闭容器中(37℃)3 h，再换上模拟再灌注液，95%O2、5%CO2进行复氧孵育2 h(37℃);(3)去除细胞外Cl－的A/R(Cl－－free A/R)组:将缺氧、复氧液换成 Cl－－free缺氧液和Cl－－free复氧液，其余操作与A/R组一致;(4)pSuper+Cl－－free A/R组:空载质粒p pSuper转染至心肌细胞中，24 h后处理同A/R组;(5)pSuper－AMPKα2 shRNA+Cl－－free A/R 组:重组质粒pSuper－AMPKα2 shRNA转染至心肌细胞中，24 h后处理同A/R组。

2.6 Western blotting检测 实验结束后，三去污剂裂解液裂解细胞，提取总蛋白，同等量蛋白质完成SDS－PAGE后，进行电转膜，再结合I抗、II抗，最后X线胶片曝光分析。

2.7 细胞存活率 采用MTT比色法检测。胰酶消化后收集细胞，每组细胞以1×104cells/well浓度接种于96孔培养板中。细胞覆盖率达70%～80%后吸出培养基。每孔加入 MTT溶液(5 g·L－1溶于PBS)20 μL，37 ℃孵育 4 h。吸弃上清液，每孔加DMSO 150 μL振荡10 min，使蓝色结晶充分溶解。490 nm波长测定其吸光度值即A值，以间接反映各组活细胞数量。

2.8 生化检测 实验结束后各组分别取孵育液200 μL，Beckman生化自动分析仪测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性。

2.9 细胞凋亡检测 处理结束后，收集细胞，在细胞悬液中加入10 μL Annexin V －FITC 和5 μL PI，轻轻混匀，避光室温反应15 min，再加入300 μL binding buffer，立即进行流式细胞仪检测。

2.10 细胞内ROS含量检测 实验结束后，用4℃预冷的PBS洗涤细胞2～3次，加入0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化细胞后收集，将配制好的10 μmol/L DCFH－DA溶液500 μL重悬细胞，37℃孵育30 min，800×g离心5 min，弃上清，预冷的PBS洗涤细胞2～3次，制成1×108cells/L的悬液，立即进行流式细胞仪检测，以488 nm为激发波长，以530 nm为发射波长。以不加DCFH－DA的1管为阴性对照。

2.11 细胞超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH－Px)活性测定 处理结束后，消化收集心肌细胞，反复冻融破碎细胞，离心后取上清液，按试剂盒说明书进行操作。

3 统计学处理

应用SPSS 11.5统计软件行组间方差分析，数据以均数±标准差(¯x±s)表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 重组质粒测序鉴定

转化菌液经北京天根生化科技有限公司测序，结果表明shRNA序列成功构建于pSuper.Retro质粒表达载体上，结果完全符合设计要求，见图1。

Figure 1.Sequencing of recombinant plasmids pSuper－ AMPKα2 shRNA1，pSuper－ AMPKα2 shRNA2 and pSuper－ AMPKα2 shRNA3(partial).图1 重组表达质粒测序鉴定结果

2 重组质粒干扰效果的检测

Control组AMPKα2蛋白在H9c2细胞中呈基础性表达;转染空载质粒pSuper后AMPKα2蛋白表达与control组比较无明显差异;而转染重组质粒pSuper－AMPKα2 shRNA 之后 AMPKα2蛋白表达则显著降低(P＜0.01)，见图2，提示重组RNA干扰质粒能有效降低AMPKα2蛋白表达。

Figure 2.Silencing efficiency of pSuper－ AMPKα2 shRNA detected by Western blotting.¯x±s.n=6.##P＜0.01 vs control group.图2 Western blotting检测pSuper－AMPKα2 shRNA的沉默效率

3 各处理组对心肌细胞存活率和LDH活性的影响

A/R组与control组比较，细胞存活率明显下降，LDH活性明显升高(P＜0.01);Cl－－free A/R组与A/R组相比，细胞存活率明显升高，LDH活性明显下降(P＜0.01)，提示Cl－－free液对心肌细胞损伤有保护作用;转染重组质粒pSuper－AMPKα2 shRNA则明显阻断了Cl－－free液的这种保护作用，细胞存活率下降，LDH活性升高，差异有统计学意义(P＜0.01)，见表 1。

4 各处理组对心肌细胞凋亡的影响

A/R组较之control组，细胞凋亡明显增加(P＜0.01);Cl－－freeA/R组与A/R组比较，细胞凋亡明显减轻(P＜0.01)，提示去除细胞外Cl－能对抗心肌A/R损伤;转染重组质粒的pSuper－AMPKα2 shRNA+Cl－－free A/R组与未转染质粒组和转染空载质粒组相比，细胞凋亡进一步明显升高(P＜0.01)，提示pSuper－AMPKα2 shRNA重组质粒能阻断Cl－－free液对抗心肌细胞A/R损伤的作用，见图3。

表1 AMPKα2低表达对各处理组心肌细胞存活率和LDH活性的影响Table 1.Effect of down－regulation of AMPKα2 on viability and LDH activity of cardiomyocytes in each group(¯x±s.n=6)

5 各处理组对心肌细胞ROS生成的影响

H9c2心肌细胞经A/R处理后，与control组比较ROS含量明显升高(P＜0.01);Cl－－free A/R与A/R组相比，ROS含量显著降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，提示Cl－－free能减少A/R损伤所致的ROS爆发;pSuper－AMPKα2 shRNA+Cl－－free A/R组与未转染组相比，则能明显增加ROS的生成(P＜0.01)，提示 pSuper－AMPKα2 shRNA 重组质粒能阻断Cl－－free抑制A/R损伤致ROS生成增加的作用，见图4。

6 各处理组对心肌细胞抗氧化物酶SOD及GSHPx活性的影响

A/R组与control组比较，细胞内抗氧化物酶SOD及GSH－Px活性显著降低，差异有统计学意义(P＜0.01);Cl－－free A/R组与A/R组相比，细胞内SOD及GSH－Px活性显著升高(P＜0.01)，而转染重组质粒pSuper－AMPKα2 shRNA后，SOD及GSH－Px活性再次下降，提示重组质粒的转染阻断了Cl－－free对心肌细胞内抗氧化酶的保护作用，见表2。

讨 论

研究发现，Cl－在心肌低渗、缺血缺氧、应急刺激等异常条件下，可引起心律失常并对心功能产生较大影响［4］。Lai等［5］利用离子敏感型玻璃微电极记录技术，成功观察到心肌缺血时细胞内Cl－浓度急剧增加，进而引发心律失常。本实验也发现，去除细胞外Cl－行A/R损伤，心肌细胞损伤较未去除细胞外Cl－组比较明显减轻，表现为细胞存活率升高，凋亡减少，并且Cl－－free对抗A/R损伤的这种保护作用伴随着ROS生成减少。

Figure 3.Effect of down－regulation of AMPKα2 on apoptosis of cardiomyocytes in each group.¯x±s.n=6.##P＜0.01 vs control group;＊＊P ＜0.01 vs A/R group;△△P ＜0.01 vs Cl－ －free A/R group.图3 AMPKα2低表达对各处理组心肌细胞凋亡的影响

Figure 4.Effect of down－regulation of AMPKα2 on ROS production of cardiomyocytes in each group.¯x±s.n=6.##P＜0.01 vs control group;＊＊P ＜0.01 vs A/R group;△△P ＜0.01 vs Cl－ －free A/R group.图4 AMPKα2低表达对各处理组心肌细胞ROS生成的影响

表2 AMPKα2低表达对各处理组心肌细胞SOD和GSHPx活性的影响Table 2.Effect of down－regulation of AMPKα2 on SOD and GSH－Px activity in cardiomyocytes in each group(¯x±s.n=6)

ROS被认为在维持心血管稳态方面有着十分重要的生理和病理生理作用，ROS的大量产生是导致心肌I/R急性损伤的主要因素之一［6］。由于ROS主要是在线粒体中产生，与能量代谢密切相关［7］，且有学者发现［8］，在β细胞中AMPK的持续激活可引起ROS的产生增加;有鉴于此，我们高度怀疑 Cl－－free对抗心肌A/R损伤的机制与AMPK有关。

RNAi是近年来新兴的研究生物体基因表达、调控与功能的技术手段，其分子机制是真核生物细胞在转录后引发的基因沉默，RNAi作为一种反向遗传学手段已经在基因功能研究中广泛应用［9］。本实验同时将3条靶序列共转染入H9c2细胞，以减少单一siRNA脱靶失效的几率，效率最大化的特异性沉默AMPKα2在H9c2心肌细胞内的表达。结果发现，AMPKα2表达被抑制后，Cl－－free对心肌细胞A/R损伤的保护作用被取消，并且ROS生成再度升高，氧化应激损害加重。综上所述，本实验成功构建了重组质粒 pSuper－AMPKα2 shRNA，并证实了 Cl－－free可以对抗心肌细胞 A/R损伤，其机制与AMPKα2抑制ROS生成、降低氧化应激水平有关。

［1］ Hardie DG，Ross FA，Hawley SA.AMPK:a nutrient and energy sensor that maintains energy homeostasis［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2012，13(4):251 －262.

［2］ Kim M，Tian R.Targeting AMPK for cardiac protection:Opportunities and challenges［J］.J Mol Cell Cardiol，2011，51(4):548－553.

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［4］ Duan DD.The ClC－3 chloride channels in cardiovascular disease［J］.Acta Pharmacol Sin，2011，32(6):675 －684.

［5］ Lai ZF，Nishi K.Intracellular chloride activity increases in guinea pig ventricular muscle during stimulated ischemia［J］.Am J Physiol，1998，275(5 Pt 2):H1613 －H1619.

［6］ 刘兴奎，段忠心，喻 田.缺血后处理对离体大鼠心肌线粒体功能的影响［J］.中国病理生理杂志，2011，27(2):229－233.

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［9］ Perkel JM.RNAi therapeutics:the teenage years［J］.Biotechniques，2012，52(6):355 －357.